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Caracterización de los mecanismos de respuesta antioxidante de Medicago Sativa a metales pesados

  • Autores: María Laura Flores Cáceres
  • Directores de la Tesis: Luis Eduardo Hernández Rodríguez (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2013
  • Idioma: español
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Ildefonso Bonilla Mangas (presid.), Cristina Ortega Villasante (secret.), Leonardo M. Casano Mazza (voc.), María Aida González Díaz (voc.), Ana M. Alvarez Fernandez (voc.)
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  • Resumen
    • Las plantas están muy expuestas a distintas adversidades del ambiente. Muchos agentes externos pueden causarles efectos altamente nocivos y como ellas son un importante eslabón de la cadena trófica, estos agentes externos pueden causar posteriormente problemas a los animales y seres humanos. Un ejemplo de ello y objeto de nuestro estudio son los metales pesados como mercurio (Hg), cadmio (Cd) o cobre (Cu), elementos que pueden ser muy tóxicos, y que se acumulan en el medio ambiente. Las plantas cuentan con una batería de mecanismos para poder crecer y desarrollarse en una gran diversidad de ambientes potencialmente perjudiciales. Por ello, es necesario descubrir y conocer estos mecanismos para desarrollar estrategias conducentes a tecnologías de fitorremediación.

      En este trabajo nos hemos centrado en estudiar los mecanismos de respuesta antioxidante de Medicago sativa, alfalfa, en presencia de estos tres metales pesados. En primer lugar, los ensayos se realizaron en un sistema hidropónico a microescala con distintas dosis de metal (0, 3, 10 y 30 ¿M) y tiempos de exposición muy cortos (3, 6 y 24 h) para determinar el umbral de toxicidad y analizar respuestas específicas y tempranas del estrés por Hg o Cd. Los mayores cambios se observaron en las raíces de plántulas donde las enzimas redox analizadas, ascorbato peroxidasa (APX), glutatión reductasa (GR) y NADPH-oxidasa, aumentaron su actividad durante las primeras horas de exposición al Cd. Sin embargo, con los tratamientos de Hg la actividad de dichas enzimas disminuyó a medida que aumentó la severidad del tratamiento. Las proteínas de choque térmico de bajo peso molecular (sHSP17.7 y sHSP17.6) se indujeron con ambos metales. Además se detectaron fitoquelatinas en respuesta a la exposición de estos dos metales. También se observó una disminución de la concentración de glutatión (GSH) y su homólogo homoglutatión (hGSH) en los tratamientos más prolongados con Hg o Cd, siendo casi indetectables en el tratamiento con Hg 30 ¿M tras 24 h.

      Además se estudió posteriormente el papel del etileno en las respuestas de estrés por Hg o Cd, bloqueando su percepción en plántulas pretratadas con el inhibidor 1-metilciclopropeno (1-MCP). Se observó que al crecer las plántulas con 1-MCP se produjo una atenuación de los efectos fitotóxicos de Cd y Hg, como mostraron varios de los parámetros de estrés medidos y como sucedió con la actividad de las enzimas antioxidantes, que fue mayor respecto a la detectada en plántulas expuestas únicamente al metal tóxico. Lo mismo se observó con las proteínas de choque térmico analizadas, cuya inducción fue mucho menor que en ausencia de 1-MCP. Asimismo, el etileno parece mediar en la producción de H2O2 extracelular, que se induce tanto por Hg como con Cd.

      Por otro lado, se estudió la importancia del GSH/hGSH en la respuesta de la alfalfa al estrés por metales y para ello se incorporó butionina sulfoximina (BSO), un potente inhibidor de la síntesis de GSH/hGSH. Las plántulas crecidas con BSO fueron mucho más sensibles a Hg o Cd, plántulas que sufrieron una fuerte inhibición del crecimiento junto con una severa disminución del contenido de GSH/hGSH y fitoquelatinas.

      Para aproximarnos a unas condiciones de crecimiento más parecidas a las existentes en un cultivo en suelo contaminado, se procedió a utilizar un sistema de cultivo semi-hidropónico a macroescala sobre un sustrato inerte de perlita. En este caso se estudiaron las respuestas de plantas de alfalfa tratadas durante 7 días con Cd 0, 6 y 30 ¿M o Cu 0, 6, 30 y 100 ¿M. Los distintos parámetros de estrés analizados confirmaron que el Cd y el Cu producen estrés oxidativo en las plantas de alfalfa, donde se apreció un aumento de la peroxidación lipídica tanto en brotes como en raíz. Se observaron asimismo cambios en la actividad de enzimas redox como APX, GR y NADPH-oxidasa en raíz; cambios más severos cuanta mayor era la concentración del metal. Por otro lado, disminuyó la concentración de GSH/hGSH; y quedó patente que el Cu no indujo la síntesis de fitoquelatinas, diferente al Cd con el cual se detectó acumulación de fitoquelatinas. En este sistema experimental se estudió la contribución de GSH/hGSH en la tolerancia a metales, observándose que para ambos metales la disminución del contenido celular provocó una mayor sensibilidad.

      Por tanto, se pudo establecer que los distintos metales dan lugar a una firma de estrés característica. Los ensayos también han mostrado la importancia del metabolismo del GSH/hGSH en la tolerancia a metales, así como la participación del etileno en las respuestas tempranas. Esta información puede ser útil para seleccionar las plantas más adecuadas, pudiendo determinarse con mayor precisión cuándo están sufriendo estrés, capaces de tolerar la presencia de metales en el medio de cultivo. Esto es necesario para poder abordar futuros ensayos de fitorremediación, para lo que es preciso contar con plantas capaces de tolerar la acumulación de metales pesados en sus órganos.

      Palabras clave: alfalfa, mercurio, cadmio, cobre, estrés oxidativo, glutatión, etileno, proteínas de choque térmico.


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