Estudio de las actividades y los centros activos de las enzimas ADPRibas-Mn y trioquinasa/FMN ciclasa
- Autores: Joaquim Rui de Castro Rodrígues
- Directores de la Tesis: José Carlos Cameselle Viña (dir. tes.), Alicia Cabezas Martín (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Extremadura ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Número de páginas: 193
- Tribunal Calificador de la Tesis: Federico Gago Badenas (presid.), Joao Nuno Meireles da Silva Gonçalves Ribeiro (secret.), Vicente Rubio Zamora (voc.), Carmen Calés Bourdet (voc.), Rosa María Pinto Corralizo (voc.)
- Materias:
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- Resumen
- español
Se han investigado las actividades y centros activos de la ADP-ribosa/CDP-alcohol difosfatasa dependiente de Mn2+ (ADPRibasa-Mn) y la trioquinasa/FMN ciclasa (TKFC), obtenidas como proteínas recombinantes. Respecto a ADPRibasa-Mn se estudiaron las enzimas de rata (�Rattus norvegicus�) y de pez cebra (�Danio rerio�). Por vez primera se ha hecho coincidir información estructural y bioquímica en la misma proteína de la familia �ADPRibase-Mn�. Se han encontrado nuevas actividades de ADPRibasa-Mn, como ADP-ribosa cíclica fosfohidrolasa y fosfodiesterasa de nucleótidos 2´,3´-cíclicos. A partir de la estructura de la ADPRibasa-Mn de �D. rerio�, y por modelado molecular, se han definido los centros activos de ambas enzimas y se identificaron una molécula de agua y un residuo de histidina bien posicionados para la reacción hidrolítica. El papel de dicho residuo se confirmó por mutagénesis. Respecto a TKFC, se estudió la enzima humana (hTKFC), un homodímero de subunidades con dos dominios (L y K). Se construyeron modelos de hTKFC unida a sustratos de quinasa, de ciclasa o sin sustratos. Simulaciones de dinámica molecular desvelaron movimientos de los dominios K necesarios para la actividad quinasa. El modelado molecular permitió identificar interacciones relevantes de diversos aminoácidos. Los estudios bioquímicos hechos con hTKFC incluyeron la demostración de que K y L por separado no tienen actividad quinasa, mientras que K tiene actividad FMN ciclasa. Además se prepararon seis mutantes puntuales que, añadidos a un séptimo anteriormente preparado, dieron información relevante sobre el centro activo y el papel de ambos dominios en la catálisis.
- English
The activities and the active centers of Mn2+-dependent ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase (ADPRibase-Mn) and triokinase/FMN cyclase (TKFC), both obtaines as recombinant proteins, were investigated. Concerning ADPRibase-Mn, the enzymes from rat (�Rattus norvegicus�) and zebrafish (�Danio rerio�) were studied. For the first time, structural and biochemical information were put together for the same protein of the ADPRibase-Mn family. Novel ADPRibase-Mn activities were found, namely cyclic ADP-ribose phosphohydrolase and 2´,3´-cyclic nucleotide phosphodiesterase. The active centers of both ADPRibase-Mn enzymes were defined from the structure of the �D. rerio� protein and by molecular modeling. A molecule of water and a histidine residue well positioned for the hydrolytic reaction were identified. The role of such residue was confirmed by mutagenesis. The study of TKFC was centered on the human enzyme (hTKFC), a homodimer of two-domain (K and L) subunits. hTKFC models bound to kinase substrates, cyclase substrate, or without substrates, were constructed. Molecular dynamics simulations revealed movements of the K domains necessary for the kinase activity. Molecular modeling led to the identification of relevant interactions of several aminoacids. Biochemical studies performed with hTKFC included the demonstration that individual K and L domains are devoid of kinase activity, while K alone is active as FMN cyclase. In addition, six point mutants were prepared and, together with another previously prepared one, gave relevant information on the active center and the role of both domains in catalysis.
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