Investigating venom composition and variation in West European vipers

• Autores: Ignazio Avella
• Directores de la Tesis: Fernando Martínez Freiría (dir. tes.), Wolfgang Wüster (codir. tes.), Juan J. Calvete (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidade do Porto ( Portugal ) en 2023
• Idioma: inglés
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  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen

  • Nos últimos anos, a aplicação de metodologias de alto rendimento (“high-throughput”) no campo da venómica veio revolucionar e renovar o interesse na investigação de venenos de cobras, levando, em pouco tempo, à produção de nova informação sobre o veneno de inúmeras espécies e fornecendo uma visão abrangente sobre a sua composição e propriedades. Este avanço metodológico permitiu acesso detalhado a alguns dos processos subjacentes à origem e evolução do veneno de cobra, com a identificação de compostos com potencial relevância médica e o desenvolvimento de ferramentas terapêuticas para mitigar o impacto de mordidas a nível mundial. No entanto, lacunas consideráveis existem na investigação de venenos de cobras, particularmente em determinadas espécies ou tópicos de estudo. Esta tese tem como principal objetivo aumentar o conhecimento atual sobre os venenos produzidos por víboras europeias, com especial ênfase em espécies do género Vipera da Península Ibérica, contribuindo desta forma para colmatar as lacunas detetadas neste campo de investigação.

    Um total de 267 estudos em venenos de cobras, publicados entre 1964 e 2021, foram revistos com o intuito de avaliar, pela primeira vez de forma quantitativa e qualitativa, as tendências e vieses na investigação neste campo. Apesar da tendência positiva no número de artigos publicados anualmente, esta análise também revelou uma desconsideração generalizada no estudo de famílias de cobras com relevância médica supostamente reduzida (e.g., Atractaspididae), sub-representação de algumas das áreas geográficas mais afetadas por mordidas de cobra (i.e., ecozonas Indomalaia e Afrotrópicas), bem como interesse limitado nos contextos funcionais e ecológicos do veneno de cobras. De facto, cobras da família Viperidae foram mais representadas do que qualquer outro taxon, os Neotrópicos foram a região biogeográfica mais representada em termos de número de espécies estudadas e a maioria das publicações focou-se na caracterização de veneno de cobra, ao passo que tópicos mais relacionados com ecologia raramente foram considerados.

    Apesar de cobras da família Viperidae serem as mais estudadas no geral, víboras da subfamília Crotalinae foram duas vezes mais representadas do que as da subfamília Viperinae (i.e., víboras verdadeiras), com relevância médica crítica em todo o Velho Mundo.

    Na Europa, a maioria dos acidentes ofídicos é causada por víboras verdadeiras do género Vipera, constituido por mais de 20 espécies. Entre estas, seis espécies de maior relevância médica são distinguidas, considerando a sua difusão na Europa e elevado número de acidents ofíficos registados: Vipera ammodytes, Vipera aspis, Vipera berus, Vipera latastei, Vipera seoanei and Vipera ursinii. De uma forma geral, os médicos europeus não têm treino específico para identificar mordidas de cobra, reconhecer os seus sintomas e manifestações clínicas nem aplicar tratamento adequado, pelo que beneficiariam de ferramentas disponíveis para auxiliar na gestão de envenenamento por Vipera. Para tal, foram definidas chaves taxonómicas para a identificação das seis espécies Vipera acima mencionadas, bem como para a sua distinção de outras cobras europeias não pertencentes ao género Vipera. Os dados atualmente disponíveis sobre a composição dos seus venenos e sintomas causados pela sua mordida foram revistos e sumariados. Foi possível obter informação sobre a composição e atividade dos venenos de V. ammodytes, V.aspis, V. berus e V. ursinii, que parecem ser caracterizados por poucas famílias de toxinas muito abundantes, responsáveis pela maior parte da sua composição (i.e., SVMP, PLA2, SVSP, CTL) em conjunto com componentes menos abundantes (e.g., DISI, CRISP, LAAO). Estes resultados estão de acordo com o padrão de composição geralmente reportado em venenos de víboras verdadeiras e com os efeitos maioritariamente hemorrágicos e citotóxicos associados a envenenamentos por viperídeos. De facto, a revisão das manifestações clínicas relacionadas com as espécies Vipera em questão mostrou que estas variam de locais requerendo apenas tratamento tópico (por exemplo, dor e inchaço) a sistémicas, potencialmente letais com necessidade de antídoto (por exemplo, insuficiência renal, alterações hematológicas). Por fim, foi definido um protocolo uniformizado para gestão clínica de mordidas de Vipera, abordando detalhadamente o tratamento dos sintomas locais e sistémicos, bem como a administração de antídoto.

    Notavelmente, as informações disponíveis sobre a composição e atividade dos venenos de V. latastei e V. seoanei eram bastante reduzidas, impedindo a avaliação detalhada e compreensiva destas duas espécies pouco estudadas. Assim, e com o objetivo de preencher esta lacuna, foi conduzido o primeiro estudo detalhado sobre a composição e variação dos venenos de V. latastei e V. seoanei, baseado na aplicação de metodologias proteómicas “bottom-up”. Relativamente a V. latastei, foram analisados os venenos de espécimes juvenis e adultos de duas localidades do norte de Portugal sob condições ambientais diferentes. Foram produzidos seis proteomas de venenos (três por população) provenientes de víboras de ambas as idades (i.e., dois juvenis e quatro adultos), bem como perfis RP-HPLC de 54 venenos provenientes de espécimes selvagens. Os perfis cromatográficos e abundâncias relativas das suas toxinas variaram entre os venenos de juvenis e adultos, sugerindo a ocorrência de alterações ontogenéticas na composição do veneno. Especificamente, metaloproteinase de veneno de cobra (SVMP) foi a família de toxinas mais abundante em venenos juvenis, enquanto proteases de serina de veneno de cobra (SVSPs), fosfolipases A2 (PLA2s) e proteínas tipo-lectina tipo-C (CTLs) foram as principais toxinas em venenos adultos. Verificou-se que os perfis RP-HPLC de veneno variam significativamente entre as localidades amostradas, indicando variabilidade geográfica. Além disso, a presença/ausência de certos picos nos perfis cromatográficos parece estar significativamente correlacionada com fatores como o tamanho e sexo das víboras. Os resultados mostram que o veneno de V. latastei é um fenótipo variável, em que diferenças intraespecíficas na sua composição provavelmente refletem diferenças na ecologia alimentar desta espécies em diferentes fases de vida e sob diferentes pressões ambientais.

    Relativamente a V. seoanei, foram analisados venenos de 49 espécimes adultos provenientes de 20 localidades ao longo da área de distribuição da espécie na Península Ibérica. O proteoma de referência do veneno de V. seoanei foi gerado com base num “pool” de venenos individuais; perfis SDS-PAGE foram produzidos para todas as amostras de venenos e os padrões de variação foram visualizados com Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS). A presença e natureza da variação nos venenos entre localidades, bem como o efeito de 14 previsores (biológicos, ecogeográficos, genéticos) na sua ocorrência, foram avaliados com a aplicação de regressão linear. O veneno incluiu pelo menos12 famílias diferentes de toxinas, das quais cinco (i.e., PLA2, SVSP, DISI, CTL, SVMP) representavam cerca de 75% de todo o proteoma. As análises comparativas do perfis SDS-PAGE mostraram semelhanças consideráveis entre as localidades amostradas, sugerindo baixa variabilidade geográfica. Análises de regressão sugeriram efeitos significativos de previsões biológicos e de habitat na reduzida variação detetada nos venenos de V. seoanei analisados. Outros fatores foram também significativamente associados à presença/ausência de bandas individuais nos perfis SDS-PAGE. Os baixos níveis de variabilidade detetados em V. seoanei podem ser o resultado de expansão populacional recente ou de outros processos além de forças seletivas positivas direcionais que atuam na manutenção do veneno como fenótipo conservado.

    A análise das tendências e vieses em estudos em venenos de cobras detetou a desconsideração consistente de determinadas grupos de cobras e tópicos de estudo. De forma similar, a revisão dos dados atualmente disponíveis sobre as seis espécies Vipera de elevada importância médica na Europa deixou a descoberto lacunas de conhecimento, em especial sobre a composição e variação intraespecífica dos seus venenos. Com esta tese, a aplicação de metodologias de venómica “bottom-up” nos venenos de V. latastei e V. seoanei permitiu dar o primeiro passo para colmatar estas lacunas e complementar o conhecimento na área. De facto, os resultados destas análises permitiram caracterizar os venenos destas víboras pouco estudadas e detetar variação intraespecífica nos seus venenos a diferentes níveis (i.e., variação ontogenética em V. Latastei; variação geográfica a diferente magnitude em V. latastei e V. seoanei), abrindo portas para estudos futuros na variação do venenos destas duas espécies. Expandir as análises proteómicas conduzidas nesta tese a outras espécies Vipera pouco estudadas, em conjunto com a implementação de análises genómicas, trancriptómicas e funcionais, de certo permitirá obter uma visão mais completa da evolução e variação do veneno de víboras europeias.

    FCUP Investigating