Análisis proteómico de membranas resistentes a detergentes (DRM) en Escherichia coli

• Autores: José E. Guzmán Flores
• Directores de la Tesis: Dimitris Georgellis (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional Autónoma de México ( México ) en 2018
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: ru.dgb.unam.mx
• Resumen
  • español

    La capacidad de las membranas biologicas para compartamentalizar diversos procesos fisiológicos como la transducción de señales, tráfico vesicular y la secrecion de proteínas ha llevado al estudio de estructuras conocidas como balsas lipídicas o microdominios de membrana. Estos microdominios se componen de proteínas y lípidos especializados y han sido descritos en una gran variedad de células eucariontes. Una de las técnicas usadas para caracterizar bioquímicamente estos microdominios, es la obtención de membranas resistentes a detergentes (DRM-Detergent-Resistant Membranes). Se ha reportado que las proteínas que contienen el dominio conservado SPFH (Stomatin, Prohibitin, Elotillin, HfIK/C) se encuentran en las preparaciones de DRM, por lo que son utilizadas frecuentemente como marcadores de balsas lipídicas. Debido a que estas proteínas con dominio SPFH tambien se han identificado en cromosomas bacterianos, incluyendo a Escherichia coli, se plantea la pregunta si existen estructuras similares a balsas lipídicas en células procariontes.

    En este trabajo, desarrollamos un protocolo para el aislamiento de DRM a partir de membranas de Escherichia coli. La membrana interna (MI) se separo de la membrana externa (ME) y se trató con diferentes relaciones detergente/proteína para determinar la condición óptima de solubilización. Las fracciones de DRM se separaron y recolectaron mediante flotación a través de un gradiente continuo de Optiprep, las fracciones recolectadas se verificaron utilizando a las proteínas con dominios SPFH como marcadores. El contenido proteico de los DRM se identificó mediante el análisis por espectrometría de masas, encontrando al menos 79 proteínas que se encontraron enriquecidas en la fracción de DRM. Las proteínas identificadas parecen estar involucradas en diversos procesos celulares como transporte y secrecion de proteínas, sintesis de ATP, metabolismo de lípidos y señalización celular.

  • English

    The capability of biological membranes to compartmentalize various physiological processes such as signal transduction, vesicular traffic, and protein secretion, has led to the study of structures known as lipid rafts or membrane microdomains. These microdomains are composed of specialized proteins and lipids and have been described in a wide variety of eukaryotic cells. One of the techniques used in the biochemical characterization of these microdomains is the generation of Detergent- Resistant Membranes (DRM). It has been reported that proteins containing the conserved SPFH domain (Stomatin, Prohibitin, Flotillin, HfIK/C) are found in DRM preparations, and therefore these proteins are typically used as lipid raft markers.

    Because such SPFH domain containing proteins have been identified in bacterial chromosomes, including Escherichia coli, raises the question whether similar membrane structures are present in prokaryotic cells.

    In this work, we developed a protocol for DRM isolation from Escherichia coli membranes. The inner membrane (IM) was separated from the outer membrane (OM) and treated by various detergent/protein ratios to determine the optimal condition of solubilization. DRM fractions were separated and collected by flotation through an Optiprep continuous gradient and verified using the SPFH containing proteins as markers. The protein cargo of DRM was identified by mass spectrometry analysis, and it was found that at least 79 proteins were enriched in the DRM fraction.

    The identified proteins appear to be involved in various cellular processes, such as protein transport and secretion, energy biosynthesis, lipid metabolism, and cellular signaling.