Structural studies on adenovirus: the human adenovirus packaging motor, and characterization of two reptilian adenoviruses
- Autores: Rosa Menéndez Conejero
- Directores de la Tesis: Carmen San Martín Pastrana (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2013
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: José López Carrascosa (presid.), José Ruiz Caston (secret.), Rubén Hernández-Alcoceba (voc.), Silvia Ayora (voc.), Daniel Luque Buzo (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
Desde su descubrimiento en tejido adenoide humano a mediados del siglo XX (Rowe et al., 1953), un gran número de adenovirus han sido detectados en huéspedes vertebrados. El interés en el estudio de adenovirus se basa en su dualidad como patógenos (del ser humano y de animales con interés económico y ambiental) y como herramientas para terapia génica y desarrollo de vacunas.
El genoma de adenovirus humano es una molécula de ADN de cadena doble de unas 35000 pb. Los genes se codifican en unidades de transcripción superpuestas, requiriendo un ¿splicing¿ o empalme alternativo del pre-ARNm. El genoma se divide en regiones tempranas (E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4) que se expresan en primer lugar durante la replicación viral, y regiones tardías (de L1 a L5) que generalmente se expresan tras el comienzo de la replicación del ADN viral (Russell, 2000).
Adenovirus es un virus sin envuelta, con cápsidas icosaédricas de unos 90 nm de diámetro. La cápsida está compuesta por tres proteínas mayoritarias (hexón, base del pentón y fibras) y cuatro proteínas minoritarias (IIIa, VI, VIII y IX) (San Martin, 2012). El ¿core¿ o núcleo del virus está compuesto por una molécula de ADN y una serie de proteínas unidas a él (V, VII, µ, PT, IVa2 y la proteasa viral).
Adenovirus infecta células epiteliales por endocitosis mediada por repector. El bajo pH del endosoma provoca cambios en la cápsida que facilitan el escape viral. A través del citoesqueleto, el virus se desplaza hacia el núcleo finalizando con la inserción del ADN viral a través de un poro nuclear. Este ADN viral se replica y se transcribe en el núcleo, donde se produce el ensamblaje de nuevos viriones (Flint, 2009). Los procesos de ensamblaje y empaquetamiento del ADN aún no se han descrito en detalle. El últimoDesde su descubrimiento en tejido adenoide humano a mediados del siglo XX (Rowe et al., 1953), un gran número de adenovirus han sido detectados en huéspedes vertebrados. El interés en el estudio de adenovirus se basa en su dualidad como patógenos (del ser humano y de animales con interés económico y ambiental) y como herramientas para terapia génica y desarrollo de vacunas.
El genoma de adenovirus humano es una molécula de ADN de cadena doble de unas 35000 pb. Los genes se codifican en unidades de transcripción superpuestas, requiriendo un ¿splicing¿ o empalme alternativo del pre-ARNm. El genoma se divide en regiones tempranas (E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4) que se expresan en primer lugar durante la replicación viral, y regiones tardías (de L1 a L5) que generalmente se expresan tras el comienzo de la replicación del ADN viral (Russell, 2000).
Adenovirus es un virus sin envuelta, con cápsidas icosaédricas de unos 90 nm de diámetro. La cápsida está compuesta por tres proteínas mayoritarias (hexón, base del pentón y fibras) y cuatro proteínas minoritarias (IIIa, VI, VIII y IX) (San Martin, 2012). El ¿core¿ o núcleo del virus está compuesto por una molécula de ADN y una serie de proteínas unidas a él (V, VII, µ, PT, IVa2 y la proteasa viral).
Adenovirus infecta células epiteliales por endocitosis mediada por repector. El bajo pH del endosoma provoca cambios en la cápsida que facilitan el escape viral. A través del citoesqueleto, el virus se desplaza hacia el núcleo finalizando con la inserción del ADN viral a través de un poro nuclear. Este ADN viral se replica y se transcribe en el núcleo, donde se produce el ensamblaje de nuevos viriones (Flint, 2009). Los procesos de ensamblaje y empaquetamiento del ADN aún no se han descrito en detalle. El último adicional para elucidar el proceso de empaquetamiento de ADN (Zhang and Arcos, 2005).
7.1.3 Otros adenovirus Los adenovirus se clasifican en cinco géneros diferentes: Mastadenovirus (infectan a mamíferos), Aviadenovirus (infectan aves), Atadenovirus (infectan reptiles, aves, marsupiales y mamíferos), Siadenovirus (infectan anfibios y aves) e Ichtadenovirus (infectan peces) (ictvdb.bio-mirror.cn/Ictv/index.htm). El uso de adenovirus que no infectan de manera natural a humanos como vectores para terapias clínicas se ha propuesto como una manera de evitar la inmunidad pre-existente. La caracterización estructural de estos adenovirus aislados de tejidos no humanos está limitada al adenovirus canino de tipo 2 (Schoehn et al., 2008) y al adenovirus ovino (Pantelic et al., 2008) ; no hay datos de la estructura completa del virión de adenovirus aislados de animales no mamíferos.
Adenovirus aislado de boa constrictor (Boa constrictor) fue propagado en la línea celular VH-2 y completamente secuenciado (Farkas, Harrach, and Benko, 2008). Más recientemente, adenovirus aislado de un lagarto mejicano (Heloderma horidum) fue aislado y propagado en cultivo celular de IgH2 (Papp, Fledelius et al. 2009). La secuencia completa de su genoma ha sido obtenida por nuestros colaboradores Dra.
Mária Benkö y Dr. Balázs Harrach (publicación en preparación), destacando la peculiaridad de que contiene dos genes que codificarían fibras, estructuras situadas en los vértices de la partícula viral implicadas en reconocimiento del huésped. Estos dos adenovirus aislados de reptiles han sido utilizados en el trabajo para la presente tesis doctoral.
7.2 Objetivos Esta tesis está dividida en dos temas principales. Uno es el estudio de la proteína IVa2 como hipotético motor de empaquetamiento del DNA en adenovirus humano, y el segundo es la caracterización molecular y estructural de adenovirus aislados de reptiles.
En particular, se han perseguido los siguientes objetivos: Proteína IVa2: ¿ Determinar la estructura cuaternaria de IVa2 in vitro.
¿ Determinar la localización de la proteína IVa2 en la partícula viral.
Adenovirus aislados de reptiles: ¿ Optimizar la propagación y la purificación de adenovirus de reptiles para su estudio estructural y molecular.
¿ Caracterizar la composición proteica de adenovirus aislados de reptiles.
¿ Caracterizar la estabilidad es los adenovirus aislados de reptiles.
¿ Si es posible, determinar la primera estructura de un adenovirus de huésped no mamífero.
7.3 Resultados Análisis de la organización de la proteína IVa2 en el virión de adenovirus.
Utilizando técnicas de inmunomarcaje y de proteólisis limitada, se ha determinado que la proteína IVa2 de adenovirus humano no se encuentra expuesta en el exterior de la cápsida viral. El análisis de fragmentos de desensamblaje de cápsidas virales ha revelado que IVa2 se encuentra interaccionando con proteínas del core viral (VII) y de los vértices (IIIa). Utilizando preparaciones de IVa2 recombinante, en su forma completa y en una variante truncada en su extremo amino-terminal, se ha determinado mediante técnicas de biología molecular, microscopía electrónica y procesamiento de imagen, que esta proteína tiene la capacidad de formar homo-oligómeros pentaméricos con forma de anillo, aunque en las condiciones ensayadas no existe una forma oligomérica mayoritaria. Mediante modelado por homología y ME3D se ha obtenido un modelo pseudo-atómico del pentámero de IVa2 que permite hacer predicciones sobre la localización y el papel de los distintos motivos funcionales de la proteína en el oligómero.
Caracterización de adenovirus que infectan reptiles.
Partiendo de adenovirus aislados de boa y de lagarto, se ha optimizado su propagación y purificación en cultivo, hasta obtener preparaciones de calidad suficiente para su estudio por técnicas de biología molecular y crio-microscopía electrónica.
Mediante ensayos de infectividad y microscopía electrónica se ha caracterizado la termo-estabilidad de estos virus y comparado con la adenovirus humano. Utilizando espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida se ha determinado cuáles de los genes dan lugar a proteínas estructurales incorporadas a los viriones. Un resultado completamente novedoso es la presencia de dos genes para fibra en el adenovirus de lagarto, que dan lugar a un complejo de tres fibras presente en cada vértice del virión. En cuanto al adenovirus de serpiente, se han realizado estudios por crio-microscopía electrónica tridimensional que han dado lugar a un mapa a 12.5 Å de resolución, el cual se ha interpretado usando modelos por homología de las estructuras de las proteínas mayoritarias de la cápsida y mapas diferencia para revelar las proteínas minoritarias.
7.4 Discusión Estado oligomérico de IVa2, localización e implicaciones para el empaquetamiento del DNA.
Trabajos anteriores apuntaban a un estado monomérico de la proteína IVa2 (Lutz and Kedinger, 1996) y (Yang, Yang, and Maluf, 2009). Sin embargo, los métodos de purificación de la proteína y las técnicas utilizadas en esas publicaciones para la detección de estados oligoméricos no pueden descartar los resultados obtenidos en esta tesis para la observación de estados oligoméricos.
La localización de IVa2 en un vértice, en una posición no accesible desde el exterior de la cápsida implicaría un modelo diferente al utilizado por bacteriófagos, un modelo más afín al descrito para Herpes virus (Rochat et al., 2011).
Ante la ausencia de modelos estructurales con los que contrastar la reconstrucción 3D del anillo de IVa2, se ha utilizado un modelo de homología remota para realizar el encaje. El modelo ha permitido predecir que el sitio de unión a DNA está localizado en el exterior del anillo. Un mecanismo combinado de captura y traslocación del DNA, podría explicar esta unión externa como paso previo al empaquetamiento del genoma viral.
para su estudio por técnicas de biología molecular y crio-microscopía electrónica.
Mediante ensayos de infectividad y microscopía electrónica se ha caracterizado la termo-estabilidad de estos virus y comparado con la adenovirus humano. Utilizando espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida se ha determinado cuáles de los genes dan lugar a proteínas estructurales incorporadas a los viriones. Un resultado completamente novedoso es la presencia de dos genes para fibra en el adenovirus de lagarto, que dan lugar a un complejo de tres fibras presente en cada vértice del virión. En cuanto al adenovirus de serpiente, se han realizado estudios por crio-microscopía electrónica tridimensional que han dado lugar a un mapa a 12.5 Å de resolución, el cual se ha interpretado usando modelos por homología de las estructuras de las proteínas mayoritarias de la cápsida y mapas diferencia para revelar las proteínas minoritarias.
7.4 Discusión Estado oligomérico de IVa2, localización e implicaciones para el empaquetamiento del DNA.
Trabajos anteriores apuntaban a un estado monomérico de la proteína IVa2 (Lutz and Kedinger, 1996) y (Yang, Yang, and Maluf, 2009). Sin embargo, los métodos de purificación de la proteína y las técnicas utilizadas en esas publicaciones para la detección de estados oligoméricos no pueden descartar los resultados obtenidos en esta tesis para la observación de estados oligoméricos.
La localización de IVa2 en un vértice, en una posición no accesible desde el exterior de la cápsida implicaría un modelo diferente al utilizado por bacteriófagos, un modelo más afín al descrito para Herpes virus (Rochat et al., 2011).
Ante la ausencia de modelos estructurales con los que contrastar la reconstrucción 3D del anillo de IVa2, se ha utilizado un modelo de homología remota para realizar el encaje. El modelo ha permitido predecir que el sitio de unión a DNA está localizado en el exterior del anillo. Un mecanismo combinado de captura y traslocación del DNA, podría explicar esta unión externa como paso previo al empaquetamiento del genoma viral.
5. Se ha propuesto un modelo de localización y organización de IVa2 en el virión.
En este modelo, IVa2 sería un anillo pentamérico localizado en la cara interna de uno de los vértices virales, y la región del genoma que contiene la secuencia de empaquetamiento se enrollaría en torno al anillo.
En cuanto a la caracterización de adenovirus que infectan reptiles: 6. Se ha optimizado la propagación y la purificación de dos adenovirus aislados de reptiles (SnAdV-1 y LAdV) para su estudio estructural y molecular.
7. Se ha caracterizado la composición proteica de SnAdV-1 y de LAdV.
8. Tanto SnAdV-1 como LAdV, presentan una termo-estabilidad mayor que la de humano (Ad5GL) y diferentes patrones de desensamblaje.
9. En LAdV, los dos genes de fibra se traducen a dos proteínas de fibra que se incorporan en el virion pero, sorprendentemente, se ensamblan tres fibras en cada vértice.
10. Se ha obtenido un mapa 3D de SnAdV-1 a 12.5 Å de resolución. Se ha interpretado con la ayuda de modelos de homología para las proteínas mayoritarias de la cápsida, revelando un conjunto de proteínas minoritarias diferente de las de adenovirus humano. Es interesante destacar que, uno de los mapas podría presentar un plegamiento típico de una proteína de reconocimiento de huésped en bacteriófagos.
