Función de la vía tasiRNAs durante la regeneración de plantas a partir de callos embriogénicos de maíz

• Autores: Brenda Anabel López Ruiz
• Directores de la Tesis: Tzvetanka Dimitrova Dinkova (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional Autónoma de México ( México ) en 2019
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: ru.dgb.unam.mx
• Resumen
  • español

    La regeneración in vitro de maíz es un proceso único que permite abordaraspectos básicos de diferenciación y reprogramación molecular sin la presencia de elementos clave de posición embrionaria. En maíz, la regeneración in vitroes empleada durante la transformación genética y la conservación del germoplasma,involucra la señalización por hormonas vegetales como las auxinas y es dependiente del genotipo yexplante utilizados.Los mecanismos regulatorios, así como las señales de diferenciación involucradas, son aún desconocidos.Se sabe que los RNAs pequeños (sRNAs) presentan una reprogramacióndurante la formación de las masas celulares totipotentes conocidas como callos. En consecuencia, se ha propuesto quelos sRNAs podrían ser reguladores clave involucrados en la totipotencia de las plantas, la respuesta a auxinas y la diferenciación celular.Los tasiRNAs (siRNAs de acción en trans) son un grupo de sRNAs que se originan a partir de los transcritosde los genes TAS. En maíz solo se hanidentificado genes ortólogos tipo TAS3de Arabidopsis thailiana. El procesamiento del transcrito o precursor, TAS3requiereun corte dirigido por miR390 yArgonauta AGO7. Los blancos de tasiRNAs originados de TAS3son los Factores de Respuesta a Auxinas 3/4(ARF3/4), por lo quese les ha denominadotasiR-ARFs.La vía se encuentra altamente conservada en las plantas y es relevante para eldesarrollo.A pesar deesto, los tasiR-ARFs no han sido estudiados en la regeneración in vitrode maíz.El objetivo de este trabajo fue analizar la expresiónde los componentes de la vía tasiR-ARF y de miRNAs involucrados en laregeneración in vitrode maíz variedad Tuxpeño VS-535.Para el proceso de inducción y proliferación de callos se emplearon embriones inmaduros,la auxina sintética: ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)y la citocinina benciladenina (BA). Se identificaron diferentes tipos de callos y etapas de regeneración que fueron caracterizadas mediante análisis histológico y microscopia electrónica de barrido.La regeneración de las plantas inicia con la formación de hoja derivada de células de tipo meristemáticasy culmina con la formación de la raíz. Se aislaron RNAs pequeños y largos en los tejidos caracterizadosque fueron analizadosmediante reverso transcripción yPCR en tiempo real(RT-qPCR).El callo no embriogénico(CNE)presentómenor abundanciade la mayoría de loscomponentesde la víatasiR-ARF, excepto para miR390, TAS3gy tasiR-ARFgrespecto al callo embriogénico (CE). Se observaronincrementos de diferentes especies de tasiR-ARFsdependiendo de laetapa de regeneración, mientras que todos los ARF3mostraron reducción significativa desde la primeraetapa de regeneración.En las mismas etapas se evaluó la acumulaciónde cinco miRNAs involucradosen en la formación del meristemo apical del brote (SAM)y de la hoja: miR156, miR160, miR164, miR166 ymiR394y desus transcritos blanco:SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN(SBP)-LIKE (ZmSBP23), ZmARF17, ZmARF19, CUP-SHAPED COTYLEDON 2 (ZmCUC2), ROLLED LEAF (ZmRLD1)y una proteína con caja F-BOX adaptadora del complejo ubiquitin ligasa(ZmGRMZM2G064954).Los principales cambios en la acumulación de miRNAs ocurrieron durante las primeras etapas deregeneración, donde la mayor abundancia de miR156, miR160ymiR166 posiblemente se relaciona con la formación de la hoja. Los resultados de este estudio muestran que existe una acumulación diferencial de sRNAs relacionados a desarrollo y sus blancosen cada una de lasetapasde desarrolloestablecidas.Esta información podría resultar útil para realizar,enun futuro, un estudio detallado que aborde la especificación celular durante la formación de novode una planta donde los sRNAs juegan un papel importante.

  • English

    In vitromaize regeneration is a unique process that can be used to address basic questions of molecular reprogramming in the absence of embryonic positional cues. This process is used for genetic transformation and germplasm conservation andthe plant regeneration success depends on the genotype and explant characteristics. The regulatory mechanisms of this process remain still unknown and important questions regarding differentiation signals remain unanswered. It is known that small RNAs (sRNAs) undergo substantial reprogramming during the induction of formation of the totipotent cell mass called callus. Thus, they are suggested to be key regulators ofplant totipotency, auxin responses and cell differentiation.The tasiRNAs (trans-acting siRNAs) are a type of sRNAs originated from TAS genestranscriptis. In maize,only TAS3genes have been identified. TAS3transcript is processed by a miR390-AGO7 guided cleavage and the resulting sRNAs target Auxin Response Factor3-4 (ARF3-4).Hence, these tasiRNAs are termed tasiR-ARFs. This pathway is highly conserved in plants and is of critical importancein the regulation of plant development.However,its functions duringin vitro plant regeneration are unclear. The aim of this study was toanalyse the expression of tasiR-ARF pathway components and development-related miRNAsduring maize Tuxpeño VS-535in vitroplant regeneration.The callus induction and proliferation protocolswereestablished using immature zygotic embryo in the presence of synthetic auxin 2,4-dicholophenoxiacetic acid (2,4-D) andthe cytokinin benzyladenine (BA).Different types ofcalli and developing stages of regeneration were recognised and characterized by light and scanning electron microscopy. Plant regeneration started with leaf differentiation from meristem-like cells and culminatedwith root formation from the regenerated plantlet. Small and long RNAs were isolated at particular developmental stagesandtheir abundance wasanalysed by reverse transcription and real time PCR (RT-qPCR). The non-embryogenic callus (NEC) presented significantly lower levels ofall tasiR-ARF pathway components, except for miR390, TAS3g and tasiR-ARFg,compared to theembryogenic callus (EC). We observed differential expression patterns for tasiR-ARFs throughout maize in vitro developmental stagesof in vitro maize regeneration. The tasiR-ARFs targets showed a substantial reduction from the first stage of plant regeneration. Furthermore, we studied the expressionat the recognized developmental stagesof five development-related miRNAs: miR156, miR160, miR164, miR166 and miR394 and their corresponding targets: SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN(SBP)-like(ZmSBP23), AUXIN RESPONSE FACTORS(ZmARF17, ZmARF19), CUP-SHAPED COTYLEDON(ZmCUC2), ROLLED LEAF (ZmRLD1)and an F-BOX ubiquitin ligase(ZmGRMZM2G064954). The major changes inmiRNA accumulation switches took place at early stages of development suggesting their participationin the leaf development. So, the higher accumulation of miR156, miR160 and miR166encompassedwiththe leafformation.This study shows that during in vitro maize regenerationadifferential accumulation of development related sRNAs and their targetstakes place,suggesting their potential role in the de novoplant formation.Such informationprovides hints to further understand cell fate specificationin the regeneration process.