Efecto de la rigidez del sustrato en el comportamiento de la línea celular hepática C9

• Autores: Ana Lucía Cabriales Torrijos
• Directores de la Tesis: Mathieu Hautefeuille (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional Autónoma de México ( México ) en 2020
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: ru.dgb.unam.mx
• Resumen
  • español

    Las fuerzas mecánicas que actúan sobre las células son apreciadas cada vez más como mediadores importantes del comportamiento celular. Regulan ampliamente la señalización celular, con efectos sobre la proliferación, diferenciación, motilidad y quiescencia.Aunque los valores de rigidez óptimos, es decir aquellos en los que las células llevan a cabo las funciones especializadas en su ambiente natural, varían ampliamente para diferentes tipos de células adherentes, en general es cierto que la proliferación celular y diferenciación aumentan con la rigidez de la matriz. Sin embargo, resulta de interés evaluar si las líneas celulares que fueron originalmente diseñadas y seleccionadas para sobrevivir en sustratos rígidos, pueden revertir su comportamiento al cultivarse en sustratos suaves. En este proyecto de tesis se estudia la influencia de la suavidad del sustrato en la proliferación, adhesión y morfología de la línea celular hepática C9, una línea que de inicio es altamente proliferativa y presenta una gran capacidad de adhesión a los sustratos de cultivo comunes, rígidos. Las células C9 fueron cultivadas sobre sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) suaves y rígidos, preparados con dos módulos elásticos diferentes en el rango de 9-11 kPa y 160-200 kPa respectivamente. Se observó una menor proliferación celular en sustratos de menor rigidez sin afectar a la viabilidad celular. Fue posible determinar además que el mecanismo mediante el cual se regula la proliferación en respuesta a la baja rigidez del sustrato esla vía de las MAPK ya que hay una disminución en la fosforilación de ERK 1/2 en los sustratos suaves. A pesar de que esta línea celular ha sido descrita como una célula epitelial hepática, su caracterización demostró que el origen de las células C9 es incierto: aunque claramente epitelial, ya que presentan expresión de marcadores de varias células epiteliales hepáticas, a su vez presentan características mesenquimales como la expresión de vimentina. Esto sugiere que, una célula que ya está expresando altosniveles de vimentina y que fue seleccionada por su capacidad de producir fuertes adhesiones en sustratos rígidos podría requerir más tiempo en sustratos suaves para revertir el fenotipo mesenquimal. Sin embargo, cuando se probó esta hipótesis a través de pases consecutivos de células C9 en el PDMS suave, se observó que la expresión de vimentina se mantuvo constante y los niveles de fosforilación de ERK aumentaron después de varios pases, desencadenando nuevamente un aumento en la proliferación celular, como una forma de adaptación o entrenamiento progresivo a la nueva suavidad del sustrato. Más aún, después de varios pases y casi en sincronía con la reactivación de la proliferación, se encontró que las células C9 aumentaron la expresión de α-SMA y adquirieron una morfología alargada, sugiriendo la adquisición de características más contráctiles, comúnmente asociadas a miofibroblastos. Este estudio muestra que la exposición por tiempos cortos de las células C9 a sustrato suaves, cuya rigidez es más cercana al rango fisiológico (5-10 kPa) en comparación con la caja de poliestireno muy rígida (GPa), promueve la disminución de la tasa de proliferación celular, como se ha reportado para otros tipos de células en PDMS. Sin embargo, una exposición prolongada hace que las células se adapten al sustrato suave a través de un cambio en morfología y fenotipo. Además, contrario al efecto observado durante periodos cortos, las células C9 aumentaron la tasa de proliferación celular. Esto sugiere que la adaptación de las líneas celulares a sustratos suaves es dependiente del tiempo de exposición.

  • English

    Mechanical forces acting on cells are increasingly appreciated as important mediators of cell behavior. They widely regulate cell signaling, with effects on proliferation, differentiation, motility and quiescence. Although optimal stiffness values, i.e. those in which cells carry out the specialized functions in their natural environment, vary widely for different types of adherent cells, it is generally true that cell proliferation and differentiation increase with matrix stiffness. However, it is relevant to evaluate whether cell lines that were originally designed and selected to survive on stiff substrates can reverse their behavior when grown on soft substrates. In this dissertation it is presented the study of the effect that substrate softness has on cellular proliferation, adhesion and morphology of the hepatic C9 cell line, a line that is highly proliferative and has a great capacity to adhere to the substrate. C9 cells were culture on soft and stiff polydimethylsiloxane (PDMS) substrates prepared with two different elastic moduli in the range of 9-11 kPa and 160-200 kPa respectively and a lower cell proliferation was observed on softest substrates without affecting cell viability. It was possible to determine that the mechanism by which proliferation is regulated in response to substrate stiffnessis the MAPK pathway since there is a decrease in ERK 1/2 phosphorylation in soft substrates. Despite the fact that this cell line has been described as an hepatic epithelial cell, the characterization showed that the origin of C9 cells is uncertain, although clearly epithelial as they present the expression of several hepatic epithelial cells markers while presenting mesenchymal characteristics such as vimentin expression. This suggests that a cell that is already expressing high levels of vimentin and wasselected for its ability to produce strong adhesions on rigid substrates might require more time on soft substrates to reverse the mesenchymal phenotype. However, when this hypothesis was tested, through consecutive passages of C9 cells in the soft PDMS, no decrease in vimentin expression was observed but rather ERK phosphorylation levels increased after several passages triggering again an increase in cell proliferation. Furthermore, after several passages and almost in synchrony with the reactivation of proliferation, C9 cells were found to increase the expression of α-SMA and acquire an elongated morphology, suggesting the acquisition of more contractile characteristics commonly associated with myofibroblasts. This study shows that short-term exposure of C9 cells to soft substrate, whose stiffness is closer to the physiological range (5-10 kPa) compared to the polystyrene (GPa) petri dish, promotes a decrease in the rate of cell proliferation, as has been reported for other cell types in PDMS. However, much longer exposure causes the cells to adapt to the soft substrate through a change in morphology and phenotype. In addition, contrary to the effect observed for short periods, C9 cells increased the rate of cell proliferation. This suggests that the cell lines adaptation to soft substrates might be time-dependent.