Mechanisms of resistance development to novel beta-lactams in pseudomonas aeruginosa
- Autores: Maria Antònia Gomis Font
- Directores de la Tesis: Antonio Oliver Palomo (dir. tes.), Carla López Causapé (dir. tes.), Antonio Doménech Sánchez (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat de les Illes Balears ( España ) en 2025
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús Blázquez Gómez (presid.), Elena Jordana Lluch (secret.), Jorge Arca-Suarez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Microbiología Ambiental y Biomédica por la Universidad de las Illes Balears
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
- español
P. aeruginosa es una de las principales causas de infección nosocomial aguda o respiratoria crónica, asociado con una elevada tasa de mortalidad y morbilidad. Este hecho resulta de su habilidad para desarrollar resistencia antibiótica por selección de mutaciones cromosómicas y/o adquisición de determinantes de resistencia. Además, su población no-clonal consta de un limitado número de clones de alto riesgo distribuidos mundialmente, que están asociados a fenotipos extensamente resistentes a antibióticos. Pues la combinación de estos mecanismos ha causado la expansión mundial de este patógeno, causando brotes y teniendo una notable repercusión a nivel económico y político.
Muchos han sido los esfuerzos en el desarrollo de nuevos antipseudomónicos eficaces durante los últimos años. De hecho, el ceftolozano/tazobactam y la ceftazidima/avibactam fueron los primeros al ser introducidos en la práctica clínica, seguidos del imipenem/relebactam y finalmente el cefiderocol. Aunque estos estén ampliando el abanico de opciones terapéuticas para combatir infecciones difíciles de tratar causadas por P. aeruginosa, se está ejerciendo una una gran presión en los mecanismos de resistencia mutacional.
Por todas estas razones, el primer objetivo de esta tesis fue evaluar la dinámica y el desarrollo de los mecanismos de resistencia a imipenem/relebactam y compararlos con los de imipenem, en cepas salvajes e hipermutadoras de P. aeruginosa. En segundo lugar, se realizó el mismo procedimiento para el estudio de la dinámica y el desarrollo de mecanismos de resistencia al ceftolozano/tazobactam e imipenem/relebactam en cepas clínicas XDR, pertenecientes a los principales clones de alto riesgo. Asimismo, también se realizaron dichos procedimientos para el cefiderocol, en cepas salvajes, hipermutadoras y XDR. Además, se pretendió demostrar el papel de las bombas de expulsión activa en el desarrollo de resistencia a estas nuevas combinaciones, particularmente desenmascarar el papel de la bomba MexCD-OprJ. Finalmente, también se quiso demostrar la posibilidad de desarrollar resistencia cruzada al cefiderocol sin previa administración de este fármaco, por exposición a otro ß-lactámico.
Para los ensayos in vitro, las cepas fueron incubadas durante 24 horas con el antibiótico de estudio y los tubos de mayor concentración con crecimiento visible fueron reinoculados en caldo fresco con concentraciones superiores para cada antibiótico. Para determinar el papel de la bomba MexCD-OprJ, se llevaron a cabo experimentos de clonación, complementación, conjugación, sensibilidad y secuenciación. Finalmente, para descifrar el mecanismo de desarrollo de resistencia cruzada al cefiderocol, se realizaron pruebas fenotípicas, genotípicas y estudios de expresión génica.
Se observó que el relebactam reduce drásticamente el desarrollo de resistencia a imipenem, tanto en cepas salvajes como hipermutadoras. Aunque éste no produjo resistencia mediada por AmpC, promovió la hiperproducción de la bomba MexAB-OprM y mutaciones en su efector MexB. Además, el desarrollo de resistencia a imipenem/relebactam fue más lento que para el ceftolozano/tazobactam en cepas clínicas XDR. También, se alcanzó resistencia de alto nivel a cefiderocol en cepas salvajes, hipermutadoras y XDR, por la selección de mutaciones en genes específicos del metabolismo del hierro (piuC), y en determinantes del resistoma (AmpCL320P). También se demostró, el papel de las mutaciones en el asa de reconocimiento de sustrato de la bomba MexCD-OprJ en el desarrollo de resistencia a los nuevos ß-lactámicos. Finalmente, se observó que la resistencia cruzada a cefiderocol, puede ser promovida por el tratamiento con otro ß-lactámico provocando la hiperexpresión de AmpC, por una deleción cromosómica en una región que contiene AmpD y PiuCD.
Así pues, la introducción de estos nuevos compuestos en la práctica clínica puede ayudar a mitigar, hasta cierto punto, el problema del resistoma mutacional de P. aeruginosa. Por esa razón, esta tesis representa un avance significativo en el conocimiento sobre la dinámica y el desarrollo de resistencia a estos fármacos, brindando claves para el futuro desarrollo de nuevos agentes.
- català
P. aeruginosa és una de les principals causes d'infecció nosocomial aguda o respiratòria crònica, associada amb una elevada tassa de mortalitat i morbilitat. Aquest fet resulta de la seva habilitat de desenvolupar resistència antibiòtica per selecció de mutacions cromosòmiques i/o l'adquisició de determinants de resistència. A més, la seva població está estructurada en un petit nombre de clons que recombinen a alta freqüència, i que estan associats amb fenotips extensament resistents, que s'han distribuït mundialment causant brots i provocant una gran repercusió a nivell econòmic i polític.
Durant les últimes dècades, s'han fet grans esforços en el desenvolupament de nous antipseudomònics. D'aquests, el ceftolozà/tazobactam i la ceftazidima/avibactam, foren els primers en ser introduïts en la pràctica clínica, seguits de l'imipenem/relebactam i el cefiderocol. Encara que el seu ús està ampliant el ventall d'opcions terapèutiques per a soques difícils de tractar, aquest fet està tenint un gran impacte en la resistència mutacional, transferènia de determinants de resistència i l'epidemiologia de clons d'alt risc.
Per aquestes raons, el primer objectiu d'aquesta tesi fou evaluar la dinàmica i el desevolupament de mecanismes de resistència a l'imipenem/relebactam i comparar-los amb els de l'imipenem, en soques salvatges e hipermutadores de P. aeruginosa. En segon lloc, es va portar a terme igualment l'estudi de la dinàmica i de desenvolupament de mecanismes de resistència al ceftolozà/tazobactam i l'imipenem/relebactam en soques clíniques XDR, pertanyent a clons d'alt risc. Finalment, es realitzà també per al cefiderocol, en soques salvatges, hipermutadores i XDR. Paral·lelament, es va pretendre demostrar el paper que juguen les bombes de transport actiu en el desevolupament de mecanismes de resistència als nous ß-lactàmics, particularment la bomba MexCD-OprJ. Finalment, es va voler evidenciar el mecanisme darrere la resistència creuada al cefiderocol en un aïllat clínic, sense prèvia exposició a aquest fàrmac.
Per estudiar-ho, les soques foren incubades durant 24 hores amb l'antibiòtic d'estudi. Els tubs amb major concentració i creixement visible foren re-inoculats en brou fresc amb concentracions superiors per a cada antibiòtic, durant 7 dies consecutius. Per esclarir el paper de la bomba MexCD-OprJ en el desenvolupament de resistència a nous ß-lactàmics, es va portar a terme experiments de clonació, complementació, conjugació, sensibilitat i seqüenciació. Finalment per el·lucidar el mecanisme darrere del desenvolupament de resistència creuada al cefiderocol, es van fer proves fenotípiques, genotípiques i estudis d'expressió.
Es va veure que el relebactam redueix el desenvolupament de resistència a l'imipenem, tant en soques salvatges com en hipermutadores. Mentres que aquest no va provocar resistència modulada per AmpC, va promoure la hiperproducció de MexAB-OprM i mutacions en l'efector MexB. A més, l'evolució de resistència a l'imipenem/relebactam fou més lenta que per al ceftolozà/tazobactam en soques clíniques XDR. De forma contrària, es va arribar a elevats nivells de resistència a cefiderocol, tant en soques salvatjes, hipermutadores com clíniques XDR, degut a la selecció de mutacions en gens específics del metabolisme del ferro (piuC), així com del resistoma (AmpCL320P). També es va demostrar, el paper de les mutacions en la nansa de reconeixement de substrat de la bomba MexCD-OprJ en el desenvolupament de resistència als nous ß-lactàmics, ampliant-ne el seu espectre. Finalment, es va obtenir que la resistència creuada al cefiderocol pot ser promoguda pel tractament amb un altre ß-lactàmic provocant la hiperexpressió d'AmpC, per una deleció cromosòmica d'una regió que conté AmpD-PiuCD.
Així doncs, la introducció d'aquests nous compostos a la clínica pot ajudar a mitigar, fins a cert punt, el problema del resistoma mutacional de P. aeruginosa. Llavors, aquesta tesi representa un avanç significatiu en el coneixement de la dinàmica i el desenvolupament de resistència a aquests fàrmacs i proporciona claus per a l'elaboració de nous agents.
- English
P. aeruginosa is one the main causes of nosocomial and chronic respiratory infections (CRI), frequently associated with significant morbidity and mortality rates. This threat results from its ability to develop antimicrobial resistance due to the selection of chromosomal mutations and/or the acquisition of resistance determinants through horizontal gene transfer (HGT). In addition, P. aeruginosa has a non-clonal population structure, with a limited number of widespread clones that are recombining at high frequencies, being commonly associated with extensively drug resistant (XDR) phenotypes. Consequently, the combinations of those mechanisms have led to the emergence of some high-risk clones, which have disseminated in hospitals worldwide. Those events have caused outbreaks, and a notable repercussion in global economics and politics.
In recent decades, significant efforts have been focused towards developing novel antipseudomonal compounds. For instance, ceftolozane/tazobactam and ceftazidime/avibactam were introduced into clinical practice, followed by imipenem/relebactam and cefiderocol. Although the use of these novel compounds is broadening the range of management options for difficult to treat (DTR) P. aeruginosa infections, this expansion is already having a major impact on mutation-driven resistance mechanisms, transferable resistance determinants and epidemic high-risk clonal lineages. For these reasons, the first objective of this thesis was to evaluate the dynamics and mechanisms of resistance development to imipenem/relebactam and to compare them with those for imipenem in wild-type and hypermutator strains of P. aeruginosa. The second was to compare the dynamics and the resistance mechanisms development to ceftolozane/tazobactam and to imipenem/relebactam in XDR clinical isolates (belonging to major high-risk clones), and to perform similar experiments with cefiderocol in wild-type, hypermutator and XDR clinical strains. Moreover, this thesis aims to demonstrate the key role of efflux pumps, particularly MexCD-OprJ, in resistance development to new combinations and, lastly, that cross-resistance to cefiderocol may be caused by prior exposure to other novel ß-lactams.
To perform the in vitro assays, strains were incubated for 24 hours with the antibiotic studied and tubes with the highest concentration showing growth were reinoculated in fresh medium containing same and above concentrations of antibiotic each day, for seven consecutive days. To elucidate the role of the MexCD-OprJ efflux pump, we conducted cloning, complementation, and conjugation experiments, along with susceptibility tests and genotypic analysis. Finally, gene expression, susceptibility assays and WGS was used to decipher an in vivo developed mechanism of cross-resistance to cefiderocol. Then, this thesis demonstrated that relebactam reduced the resistance development to imipenem in wild-type and hypermutator strains. Although relebactam reduced AmpC-mediated resistance, it promoted the overproduction of MexAB and the selection of mutations in the MexB. Additionally, resistance imipenem/relebactam was achieved more slowly than to ceftolozane/tazobactam in XDR evolved mutants. In contrast, high resistance level to cefiderocol was developed in wild-type and XDR strains, driven by mutations in iron-uptake genes (piuC) and resistome determinants (AmpCL320P). Moreover, we first demonstrated the role of mutations in the substrate recognition loop of MexCD-OprJ in the resistance development to new combinations, broadening the substrate spectra and being able to extrude them. Finally, we concluded that cross-resistance to cefiderocol developed in vivo in a patient was due to treatment with another ß-lactam that caused AmpC overexpression, resulting from a chromosomal deletion including PiuCD-AmpD region.
Therefore, the introduction of new ß-lactam compounds into clinical practice may help to mitigate, to some extent, the problem of mutational resistome of P. aeruginosa. For this reason, the present thesis represents a significant advancement in understanding the dynamics and resistance development to these novel compounds and provides clues for the future development of novel agents.
- español
