Caracterización bioquímica de la cistationina β-sintasa: propiedades redox del hemo y reactividad de su producto, el sulfuro de hidrógeno

• Autores: Juan Sebastián Carballal Zeballos
• Directores de la Tesis: Beatriz Alvarez (dir. tes.), Rafael Radi (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de la República (Uruguay) ( Uruguay ) en 2011
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen

  • Este trabajo se centra en una de las enzimas del metabolismo de aminoácidos azufrados, la cistationina ß-sintasa (CBS). La CBS cataliza la reaccion de condensacion de homocisteina y serina para formar cistationina en la primera reaccion de la via de la transulfuracion, que conduce a la formacion de cisteina a partir de metionina. Ademas puede catalizar la producción de sulfuro de hidrógeno, molécula de creciente interés por su capacidad de modular procesos fisiologicos en mamiferos, actuando como neuromodulador y vasodilatador. La elevacion en la concentracion plasmatica de homocisteina, que puede deberse a deficiencias en la CBS, constituye por causas aun desconocidas, un factor independiente de riesgo de enfermedades cardiovasculares.

    La CBS posee un cofactor piridoxal fosfato esencial para la catalisis y un inusual grupo hemo, hexacoordinado con cisteina e histidina, de funcion desconocida. En el curso del trabajo de doctorado, nos enfocamos en las propiedades redox del hemo de la CBS recombinante humana. El potencial de reduccion fue determinado por titulacion potenciométrica como -291 ± 5 mV (pH 7.2). Mediante espectrofotometria de flujo detenido, se estudió la cinética de reacción entre el oxigeno y la CBS previamente reducida, determinando una constante de velocidad de (1.11 ± 0.07) x 105 M1 s1 a pH 7.4 y 25 C. La ausencia de cinética de saturación o de especies intermediarias detectables sugirio un mecanismo de esfera externa. Esta reacción dio lugar a la formación de radical anion superoxido. Asi, de existir la CBS reducida in vivo, podria constituir una nueva fuente de generacion de superoxido en el compartimento citosolico, proponiendo un mecanismo novedoso de formación de especies reactivas a partir de las vias del metabolismo de la homocisteina. Tambien se caracterizo la cinetica de reoxidacion del producto de reacción de la CBS con monoxido de carbono, el Fe(II)CO, especie para la que se propuso un rol sensor.

    El conocimiento de la reduccion biologica del hemo en la CBS constituye un punto central a la hora de asignar un rol para este cofactor en la proteina, puesto que en estado férrico el hemo es muy estable y no pierde la coordinacion con cisteina ni une ligandos exógenos. El valor del potencial de reduccion determinado, aunque es bajo, no lo es tanto como para impedir su posible reduccion in vivo. Posibles candidatos para efectuar esta reduccion en sistemas biologicos, podrian ser flavoproteinas localizadas, al igual que la CBS, en el compartimento citosolico. Por tanto, en este trabajo se exploró la posible reduccion de la enzima por fracciones subcelulares citosolicas, asi como con flavino reductasas purificadas, obteniendo evidencia de esta reduccion en presencia de la enzima metionina sintasa reductasa.

    Por último se abordó el estudio de la bioquímica del sulfuro de hidrógeno, caracterizando su reactividad con diversos oxidantes de interes biologico. La constante de velocidad para la reaccion directa, por dos electrones, con el peroxinitrito fue determinada como (4.8± 1.4) x 103 M1 s1 a pH 7.4 y 37 ℃. A su vez, a bajas concentracione s de sulfuro de hidrogeno se evidencio un incremento en el consumo de oxigeno, consistente con un mecanismo de oxidacion por un electron que inicio una cadena de reacciones radicalares.

    Estas reacciones fueron ademas estudiadas en forma complementaria mediante simulaciones asistidas por computadora. Las reacciones de oxidacion por peroxido de hidrogeno, hipoclorito y taurina cloramina, presentaron constantes de velocidad de (0.73 ± 0.03), (8 ± 3) x 107 y (303 ± 27) M'1 s*1, respectivamente (pH 7.4, 37 ℃). A su vez, se comparo la reactividad del sulfuro de hidrogeno frente a estos oxidantes respecto a la de tioles de bajo peso molecular como cisteina y glutation. Aunque del analisis de estos resultados se desprende que de acuerdo a las bajas concentraciones del sulfuro en diferentes tejidos, su capacidad antioxidante no daria cuenta de los efectos citoprotectores reportados, creemos que estos estudios contribuyen a comprender la quimica de esta molecula y dan consistencia a mecanismos de accion fisiologica y farmacológica considerando sus posibles aplicaciones terapéuticas.