Activación glial y precursores de mastocitos asociados a la neuroinflamación en la Esclerosis Lateral Amiotrófica

• Autores: Mariángeles Kovacs
• Directores de la Tesis: Luis Barbeito (dir. tes.), Emiliano Trias (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de la República (Uruguay) ( Uruguay ) en 2023
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    Las enfermedades neurodegenerativas constituyen uno de los grupos de enfermedades de mayor relevancia en la sociedad moderna. En primer lugar, por su impacto socioeconomico debido a su creciente prevalencia, lo cual puede ser explicado por el aumento de la expectativa de vida de la poblacion. En segundo lugar, son enfermedades que a pesar de decadas de investigacion biomedica, no cuentan con estrategias terapeuticas efectivas para su tratamiento. Un informe de la OMS/OPS en 2020, estima que a nivel mundial se acumulan 35 millones de personas con Enfermedad de Alzheimer (EA), 23 millones con Enfermedad de Parkinson y 2 millones con Esclerosis Multiple. En Uruguay se estimo en 2010 que existian 54.000 pacientes con EA, cifra que se proyecta a 77.000 personas en el ano 2030 y a 112.000 personas en el 2050, lo que implicara un incremento del 107%.

    La principal característica de las enfermedades neurodegenerativas es la muerte selectiva de neuronas y la perdida de sinapsis, lo que se acompana típicamente de neuroinflamación cronica, caracterizada por la activacion de celulas gliales y por la infiltración de células del sistema inmune, incluyendo linfocitos, monocitos y mastocitos. Estas celulas se organizan alrededor de las neuronas en degeneracion, constituyendo un microambiente celular neurodegenerativo que contribuye a acelerar la progresion lesional. Nuestro grupo de investigacion ha contribuido a la comprension de los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la progresion de la Esclerosis Lateral Amiotrofica (ELA), una enfermedad neurodegenerativa paradigmatica que afecta a las motoneuronas superiores e inferiores y produce axonopatía periferica y paralisis muscular.

    El objetivo general de este proyecto de doctorado fue estudiar con mayor profundidad como se constituye el microambiente celular neuroinflamatorio en la ELA. Focalizamos la investigacion en la emergencia de fenotipos gliales aberrantes y de precursores hematopoyeticos tanto de microglia como de mastocitos a lo largo de la via motora. En la médula espinal degenerante de pacientes con ELA y de un modelo animal SOD1G93A, analizamos la posible emergencia de precursores hematopoyeticos CD34+ y c-Kit+, los que luego de infiltrar el Sistema Nervioso Central (SNC) podrian diferenciarse en celulas macrofagicas o microglías, así como tambien en mastocitos. Tambien nos propusimos estudiar los efectos del farmaco masitinib, un inhibidor de receptores de tirosina quinasa como c-Kit y CSF-1R, cuyo mecanismo de accion en la ELA podria estar asociado a la modulación de células gliales e inmunitarias.

    En la Publicacion 1 de la Tesis logramos identificar una subpoblacion, hasta ahora desconocida, de precursores microgliales que expresan el receptor CD34 tanto en la medula espinal post-mortem de pacientes, como en el modelo murino de ELA que expresa la mutacion hSOD1G93A. El receptor CD34 se expresa comunmente en precursores hematopoyeticos, sugiriendo la infiltracion de estos precursores al microambiente celular degenerativo en la ELA. Se demostro que las celulas CD34+ proliferan activamente y forman "clusters" en las cercanías de las motoneuronas en degeneración en la médula espinal.

    Ademas, por primera vez, las celulas CD34+ fueron aisladas en la fase no-adherente de cultivos celulares primarios de la medula espinal sintomatica, dando lugar a microglías diferenciadas en la fase adherente luego de sucesivos pasajes. Este hallazgo sostiene el concepto de que celulas inmaduras o precursores provenientes de la periferia, son capaces de infiltrar el SNC en la ELA, adoptando luego un fenotipo diferenciado regulado por factores locales. Este estudio fue publicado en 2019 bajo el título "CD34 Identifies a Subset of Proliferating Microglial Cells Associated with Degenerating Motor Neurons in ALS" en la revista International Journal of Molecular Sciences (1).

    En las Publicaciones 2 y 3 nos propusimos desafiar la hipotesis de que precursores de mastocitos derivados de precursores CD34+/c-Kit+ podian infiltrar las vias motoras en degeneración, tanto a nivel central como periferico, orquestando así la inflamación crónica.

    Existen muy pocos datos en la literatura sobre el papel patogenico de los mastocitos en neurodegeneracion y particularmente en la ELA. Los mastocitos son celulas poco numerosas en los tejidos pero tienen un enorme potencial proinflamatorio, de forma que podrian orquestar la cronicidad de la neuroinflamacion y alterar la integridad de la barrera-hemato encefalica (BHE) en la ELA. Nuestros resultados en tejido post-mortem de pacientes, así como tambien en modelos animales de ELA, muestran que los precursores de mastocitos c- Kit* y mastocitos diferenciados infiltran las vias motoras del Sistema Nervioso Periferico (SNP). Pudimos identificar mecanismos quimiotacticos y de diferenciacion de mastocitos que implican a la expresion de factores troficos como Stem Cell Factor (SCF), que es el ligando del receptor c-Kit, en las celulas de Schwann denervadas y macrofagos. De la misma forma, demostramos que en la medula espinal en la ELA se acumulan precursores de mastocitos c-Kit+ asociados a alteraciones microvasculares de la BHE y motoneuronas espinales afectadas. Por primera vez, pudimos aislar estos precursores de mastocitos c-Kit+ en cultivo y demostrar su diferenciacion en mastocitos maduros ex vivo. Tambien mostramos la asociacion espacial entre precursores de mastocitos con astrocitos reactivos que expresan SCF, aportando un mecanismo novedoso que explica la quimiotaxis y diferenciacion de los precursores de mastocitos en la medula espinal de la ELA. Finalmente, mostramos evidencia de que los mastocitos de la medula espinal pueden ser un blanco terapeutico de masitinib, un farmaco en estado avanzado de desarrollo en la ELA. Este estudio sostiene el concepto de que los mastocitos son celulas inmunes que contribuyen a la neuroinflamacion y remodelacion tisular en la ELA, y fueron publicados bajo los titulos "Schwann cells orchestrate peripheral nerve inflammation through the expression of CSF1, IL-34, and SCF in amyotrophic lateral sclerosis" en la revista GLIA (Trías et al, 2020) y "The pathogenic role of c-Kit+ mast cells in the spinal motor neuron-vascular niche in ALS" en la revista Acta Neuropathologica Communications (2).

    En conclusion, nuestro trabajo de tesis ha permitido avanzar significativamente en la comprension de la neuroinflamacion en la ELA, tanto a nivel del SNC como del SNP, permitiendo identificar nuevos tipos celulares de origen hematopoyetico y con un claro potencial patogenico en la ELA, ademas de ser blancos terapeuticos de novedosos fármacos.

  • English

    Neurodegenerative diseases are one of the most important groups of diseases in modern society. First, there is a strong socioeconomic impact associated to them due to its increasing prevalence, which can be explained by the population's life expectancy increase.

    Secondly, despite decades of biomedical research, no effective therapeutic strategies exist to treat neurodegenerative diseases. A WHO/PAHO report in 2020 estimates that there are 35 million people worldwide with Alzheimer's disease (AD), 23 million with Parkinson's disease, and 2 million with Multiple Sclerosis. In Uruguay, it was estimated that in 2010, that there were 54,000 patients with AD, a number that is projected to reach 77,000 people by the year 2030 and 112,000 people by 2050, which implies a 107% increase.

    The main pathological characteristic of neurodegenerative diseases is the selective loss of neurons and synapses, which is typically accompanied by chronic neuroinflammation, characterized by the activation of glial cells, as well as the infiltration of immune system cells, including lymphocytes, monocytes, and mast cells. These cells are organized surrounding degenerating neurons, constituting a neurodegenerative cellular microenvironment, which contributes to accelerating disease progression. Our research group has contributed to the understanding of the molecular and cellular mechanisms underlying the progression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), a paradigmatic neurodegenerative disease that affects upper and lower motor neurons and produces peripheral axonopathy and muscle paralysis.

    The general aim of this doctoral thesis was to study in greater depth how the neuroinflammatory cellular microenvironment is constituted in ALS. We have focused our research on the emergence of aberrant glial phenotypes and hematopoietic precursors of both microglia and mast cells along the motor pathway. In the degenerating spinal cord of patients with ALS and in a SOD1G93A animal model, we analyzed the emergence of CD34+ and c-Kit+ hematopoietic precursors, which after infiltrating the Central Nervous System (CNS) could differentiate into phagocytic cells or microglia, as well as into mast cells. We also set out to study the effects of a drug, masitinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor targeting c-Kit and CSF-1R, whose mechanism of action in ALS could be associated with the modulation of glial and immune cells.

    In the first publication of this thesis, we identified a yet unknown population of microglial precursors that express the CD34 receptor, both in the postmortem spinal cord of patients and in the mouse model of ALS that expresses the hSOD1G93A mutation. The CD34 receptor is commonly expressed in hematopoietic precursors, suggesting the infiltration of these precursors into the degenerative ALS cellular microenvironment. CD34+ cells were shown to actively proliferate and form clusters in the surroundings of degenerating motoneurons in the spinal cord. Furthermore, for the first time, CD34+ cells were isolated in the non- adherent phase of primary cell cultures obtained from the symptomatic spinal cord, giving rise to differentiated microglia in the adherent phase after successive passages. This finding supports the concept that immature cells or precursors from the periphery can infiltrate the CNS are capable of infiltrating the CNS in ALS and later adopt a differentiated phenotype as regulated by local factors. This study was published in 2019 under the title "CD34 Identifies a Subset of Proliferating Microglial Cells Associated with Degenerating Motor Neurons in ALS" in the International Journal of Molecular Sciences (Kovacs et al., 2019).

    During the second, and third publications, we set out to challenge the hypothesis that mast cell precursors derived from CD34+/c-Kit+ precursors could infiltrate degenerating motor pathways, both in the CNS and Peripheral Nervous System (PNS), thereby orchestrating chronic inflammation. There are very little data in the literature on the pathogenic role of mast cells in neurodegeneration and particularly in ALS. Mast cells occur in low numbers in the tissues but have enormous pro-inflammatory potential, so they could orchestrate the chronicity of neuroinflammation and alter the integrity of the blood-brain barrier (BBB) in ALS. Our results in postmortem tissue from patients and animal models of ALS showed that c-Kit+ mast cell precursors and differentiated mast cells infiltrate the motor pathways of the PNS. We were able to identify chemotactic and mast cell differentiation mechanisms, which involve the expression of trophic factors such as Stem Cell Factor (SCF), the c-Kit ligand, in denervated Schwann cells and macrophages. In the same way, we demonstrated that in the spinal cord in ALS, c-Kit+ mast cell precursors accumulate in association with microvascular alterations of the BBB and affected spinal motoneurons. For the first time, we were able to isolate these c-Kit+ mast cell precursors in cell culture and demonstrate their differentiation into mature mast cells ex vivo. We were also able to show the spatial association between mast cell precursors with reactive astrocytes expressing SCF, providing a potential mechanism explaining the chemotaxis and differentiation of mast cell precursors in the ALS spinal cord. Finally, we show evidence that spinal cord mast cells may be therapeutic targets of masitinib, a drug in advanced development in ALS. This study supports the concept that mast cells are immune cells that contribute to neuroinflammation and tissue remodeling in ALS and was published under the titles "Schwann cells orchestrate peripheral nerve inflammation through the expression of CSF1, IL-34, and SCF in amyotrophic lateral sclerosis" in the journal GLIA (Trias et al, 2020) and "The pathogenic role of c- Kit+ mast cells in the spinal motor neuron-vascular niche in ALS" in the journal Acta Neuropathologica Communications (Kovacs et al, 2021).

    In conclusion, our thesis work has made it possible to make significant progress in the understanding of neuroinflammation in ALS, both at the CNS and PNS, making it possible to identify new cell types of hematopoietic origin and with clear pathogenic potential in ALS, making them potential therapeutic targets of novel drugs.