Utilidad de marcadores biológicos, clínicos y de imagen en el diagnóstico, pronóstico y calidad de vida en pacientes con cáncer de endometrio
- Autores: Kristina Aghababyan
- Directores de la Tesis: Juan Gilabert Estellés (dir. tes.), Francisco Javier García Oms (codir. tes.), Josep Marí Alexandre (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2024
- Idioma: español
- Número de páginas: 149
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Antonio Llueca Abella (presid.), Alicia Hernández Gutiérrez (secret.), Pilar Medina Badenes (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina por la Universitat de València (Estudi General)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: webges.uv.es (pdf)
- Resumen
Departamento de Pediatría, Obstetricia y Ginecología Resumen de Tesis doctoral Autora: Apellidos: AGHABABYAN Nombre: CRISTINA NIF: 54953491M Teléfono: 695.410.909 Correo electrónico: krisag@alumni.uv.es Directores: Dr. Juan Gilabert Estellés Dr. Josep Marí Alexandre Dr. Francisco Javier García Oms TÍTULO DEL PROYECTO UTILIDAD DE MARCADORES BIOLÓGICOS, CLÍNICOS Y DE IMAGEN EN EL DIAGNOSTICO, PRONÓSTICO Y CALIDAD DE VIDA EN PACIENTES CON CÁNCER DE ENDOMETRIO 2. INTRODUCCIÓN El cáncer de endometrio (CE) es la neoplasia del tracto genital femenino más frecuente en Europa, con una prevalencia en los últimos 5 años de 482.952 casos según los datos de Globocan 2020. El número estimado de nuevos casos anuales diagnosticados en Europa es de 130.051 y el número de fallecimientos es de 29.963.
En España, además de ser el tumor maligno más frecuente de tracto genital femenino, es el segundo en mortalidad, tras el cáncer de ovario. En el año 2020 se diagnosticaron 6.597 nuevos casos y se registraron 1.647 muertes por esta enfermedad, lo que supone una incidencia de 13.1 por cada 100.000 mujeres y una tasa de mortalidad de 2.2 por cada 100.000 mujeres1.
La sintomatología cardinal de sospecha es el sangrado uterino anormal, sobre todo en las mujeres postmenopáusicas.
La exploración ginecológica se complementaría con la ecografía transvaginal (ETV) para descartar patología orgánica como pólipo endometrial o mioma uterino, además para valorar el grosor de endometrial. En las pacientes postmenopáusicas se recomienda tomar como punto de corte 3mm del grosor endometrial medido por ETV para realizar biopsia endometrial2,3.
Actualmente el CE carece de biomarcadores diagnósticos específicos. Entre los posibles biomarcadores para CE, el más estudiado es el CA-125. Este marcador fue descrito por primera vez por Bast y colaboradores en el año 19814.
Estudios más recientes reflejan que la proteína del epidídimo humano HE-4, originalmente propuesta para el estudio del cáncer de ovario, puede presentar valores elevados en el CE previo a la intervención quirúrgica y se correlaciona mejor con el grado de invasión miometrial y el tamaño de tumor que el CA-1255,6. No obstante, esta proteína presenta una sensibilidad baja7. Es por ello que sería de gran valor descubrir nuevos biomarcadores que puedan presentar una utilidad diagnóstica y pronóstica para el CE superior a la de los marcadores mencionados y que pueda ser empleada en la práctica clínica.
El abordaje quirúrgico de cáncer de endometrio tipo I (endometrioide) depende del estadio de la enfermedad y del grado histológico, pudiendo implicar la realización de tan solo una histerectomía total con anexectomía bilateral hasta histerectomía total más anexectomía bilateral y además estadiaje ganglionar.
En los últimos años, la exploración ecográfica trasnsvaginal/trasnrectal (ETV 2D/ETR) y la ecografía 3D realizada por los expertos en esta disciplina está cobrando más fuerza por su precisión, que según varias publicaciones relevantes es superponible a la resonancia magnética (RM)8,9,10.
La capacidad del detección precoz de CE supone la ventaja de un diagnóstico y tratamiento prematuro del mismo, algo que deriva en un aumento de la supervivencia para estas pacientes. Por otra parte, los tratamientos actuales como el abordaje quirúrgico radical, tanto el tratamiento adyuvante como la quimioterapia y la radioterapia suponen no solo el impacto cuantitativo aumentando la supervivencia, sino además un impacto cualitativo, en cuanto a la afectación la calidad de vida (CV) de estas pacientes, siendo tratamientos considerablemente tóxicos. En base a lo expuesto es fundamental la valoración de la CV de las pacientes para determinar el impacto de la enfermedad sobre las mismas en términos de sintomatología propia de la enfermedad, las complicaciones postquirúrgicas, toxicidad de tratamiento adyuvante y afectación psicoemocional.
La Organización Europea para la Investigación y el Tratamiento del Cáncer (EORTC, por sus siglas en inglés), es un organismo internacional en el cual participan los investigadores de distintos países. Tiene representación en 48 países de todos los continentes. La EORTC tiene como uno de los objetivos principales aumentar la supervivencia y la calidad de vida de las y los pacientes con cáncer, probando nuevas estrategias terapéuticas basadas en medicamentos, cirugía y radioterapia existentes.
Este grupo decidió crear un sistema modular de medida de la CV, conformado por un cuestionario general QLQ-C30, el cual recoge las áreas comunes del cáncer y sus tratamientos. La versión tercera de este cuestionario (EORTC QLQ-C30 versión 3.0) es la que está actualmente en uso11.
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Nuestra hipótesis de trabajo es la siguiente: Demostrar si los marcadores ecográficos y moleculares permiten valorar la extensión de la enfermedad y el pronóstico del cáncer de endometrio, respectivamente.
Objetivos primarios: 1.1. Validar el rendimiento diagnóstico de la ecografía trasvaginal/transrectal para estudio de extensión de estadios iniciales de CE (Bloque 1).
1.2. Estudiar la capacidad pronóstica de nuevos biomarcadores moleculares en el CE (Bloque 2).
Objetivos secundarios: 2.1. Valorar la calidad de vida en pacientes con CE mediante los cuestionarios EORTC: módulo QLQ-30 (global) y QLQ-EN24 (específico para cáncer de endometrio).
2.2. Analizar las diferencias de coste económico entre el estudio de extensión realizado con ecografía junto al TC o realizado con RM.
2.3. Analizar los parámetros oncológicos como ILE y SG.
2.4. Analizar los parámetros quirúrgicos de las pacientes intervenidas mediante abordaje mínimamente invasivo.
4. MATERIAL Y MÉTODOS Se trata de un estudio de casos y controles ambispectivo y multicéntrico. El reclutamiento de pacientes y muestras se ha llevado a cabo entre los años 2016 y 2023. Las muestras biológicas incluidas en el estudio están recogidas en la colección de tejidos del grupo en la FIHGUV, adscrita al registro nacional de biobancos, sección colecciones (C.0006194). Todas las participantes en el estudio han sido informadas y han firmado el consentimiento informado para la obtención y almacenamiento de las muestras biológicas. Este estudio se ha llevado acabo en las instalaciones del CHGUV y de la FIHGUV. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación con medicamentos de nuestra institución (Aprobación CEIm CHGUV 7/02/2016 y 28/03/2019) (Anexo 1 y 2) y se llevó a cabo de acuerdo con los Principios Éticos de Helsinki y sus consiguientes modificaciones12.
Para alcanzar los objetivos, el proyecto se ha dividido en 2 bloques (bloque 1 y 2). Se ha contado con la participación de 145 pacientes, 107 en el grupo de CE y 38 en el grupo control.
4.1. BLOQUE 1 responde a los objetivos: 1.1. Validar el rendimiento diagnóstico de la ecografía transvaginal/transrectal para estudio de extensión local deL CE; 2.1. Valorar la calidad de vida mediante los cuestionarios EORTC: módulo QLQ-30 (global) y QLQ-EN24 (específico para CE); 2.2. Analizar las diferencias de coste económico entre estudio de extensión realizado con la ecografía junto al TC o realizado con RNM; 2.3. Analizar parámetros oncológicos como ILE, SG; 2.4. Analizar los parámetros quirúrgicos de las pacientes intervenidas mediante abordaje mínimamente invasivo.
4.1.1. Participantes Criterios de inclusión Edad > de 18 años Pacientes con CE (con confirmación histológica en la BE) Tratamiento con cirugía como primera opción Informadas sobre estudio firmando CI Criterios de exclusión Edad < de 18 años Pacientes con la histología distinta a CE Pacientes con CE no tratadas con cirugía No firma de CI 4.1.2. Exploración con ecografía La exploración ecográfica se realzó en la posición de litotomía. Se han tomado las medidas del útero y del tumor endometrial en los tres planos ortogonales. Además se reflejaron todos los hallazgos de la patología adicional como miomas uterinos o signos de adenomiosis. El diámetro anterioposterior del útero y endometrio fue medido en el plano sagital y el diámetro laterolateral del útero en el plano transverso. Se ha medido el mínimo margen libre de tumor, mediante distancia mínima del borde tumoral hasta la serosa en cualquier plano.
La IM se valoró mediante la impresión subjetiva del examinador midiendo desde la JZ hasta el punto más profundo del borde tumoral intramiometrial, es decir, en su diámetro máximo en cualquier plano126.
4.1.3. Exploración con resonancia magnética La RM se realizó según el protocolo establecido en el servicio de radiodiagnóstico de nuestro centro (CHGUV).
La paciente se debe presentar a la prueba en ayunas de al menos 6 horas.
Se determinaron las siguientes variables: 1). Tamaño uterino: diámetros longitudinal-transverso-anteroposterior.
2). Tamaño tumoral: diámetros longitudinal-transverso-anteroposterior.
3). La profundidad de infiltración miometrial 4). Afectación de cérvix uterino 5). Adenopatías afectadas 6). Presencia de metástasis 4.1.4. Valoración de calidad de vida Se valoró la CV mediante cuestionarios EORTC: módulo QLQ-C30 (global) y QLQ-EN24 (específico para CE).
4.1.5. Análisis de coste económico del estudio por imagen En este apartado hemos realizado el cálculo de coste económico para el estudio prequirúrgico por imagen teniendo en cuenta el precio de cada técnica. Hemos calculado el coste total de las RM realizadas a todas las pacientes. Por otra parte, hemos calculado el coste total de los TC en supuesto caso de que el estudio de extensión se realizase mediante esta técnica y la diferencia que supondría entre ambos.
4.1.6. Análisis de los parámetros oncológicos Hemos realizado el cálculo de los parámetros oncológicos como SLE y SG del total de las pacientes y agrupando según la histología y estadio de la enfermedad.
4.1.7. Análisis de los parámetros quirúrgicos Se revisaron los datos de los procedimientos quirúrgicos según la vía de abordaje, la técnica quirúrgica, el número de los ganglios reclutados, la pérdida sanguínea máxima, el tiempo quirúrgico, las complicaciones y los días de estancia hospitalaria. Para ello los datos de se recogían de la historia clínica de las pacientes del programa de PANGEA en un Exel () con las variables respectivas. Hemos comparado los datos obtenidos para cada técnica de abordaje mínimamente invasivo con el fin de analizar las diferencias entre las dos técnicas.
4.2. BLOQUE 2 responde al objetivo: 1.2 estudiar la capacidad pronóstica de nuevos biomarcadores para el estudio de extensión y recurrencia de la enfermedad.
4.2.1.Participantes Criterios de inclusión pacientes Edad > de 18 años Pacientes sanas, intervenidas por ET LPS Informadas sobre estudio firmando CI Criterios de exclusión pacientes Edad < de 18 años Tratamiento hormonal 3 meses previos Tratamiento anticoagulante 3 meses previos No firma de CI Criterios de inclusión grupo control Edad > de 18 años Pacientes sanas, intervenidas por ET LPS Informadas sobre estudio firmando CI Criterios de exclusión grupo control Edad < de 18 años Tratamiento hormonal 3 meses previos Tratamiento anticoagulante 3 meses previos No firma de CI 4.2.2. Muestras biológicas De todas las mujeres del estudio se obtuvo una muestra de biopsia endometrial y, para aquéllas que fue posible, una muestra pareada de sangre total.
Las muestras de sangre se extrajeron antes de la inducción de la anestesia y se recogieron en tubos Vacutte (Greiner Bio-One) que contenían citrato trisódico al 3.2%. Se centrifugaron a 1800 xg durante 30 min a 4ºC y los sobrenadantes fueron alicuotados y almacenados a -80ºC hasta su uso.
Las muestras de biopsia endometrial fueron extraídas con la cánula de Cornier® previo al inicio de la intervención tras inducción de anestesia, depositando las mismas en un tubo falcon de 50mL con 7mL de PBS estéril, manteniéndolo en nevera (T=4ºC) hasta su procesado en la FIHGUV (intervalo de tiempo < 1h). Posteriormente fueron lavadas con tampón PBS 1X en frío (4ºC) para eliminar restos sanguíneos. Para la extracción de ARN y proteína, una parte del tejido fue congelado y almacenado en nitrógeno líquido. Para verificar el diagnóstico anatomopatólogo, el resto de tejido fue fijado toda la noche a 4ºC y posteriormente embebido en bloques de parafina.
4.2.3. Extracción proteica Se utilizó el siguiente tampón de inhibidores (pH=8) para la extracción de proteínas: HEPES (10mM), EDTA (1mM), EGTA(1mM), KCl (10mM), DDT(1mM), NaF (5mM), Na2VO4 (1mM), Na2MoO4 (10mM), leupeptina (1g/mL), aprotinina (0,1g/mL), fluoruro de fenil metil sulfonilo (0,5mM).
Para la extracción proteica, se añadió 1mL de tampón de inhibidores a los tejidos previamente descongelados sobre hielo y se disgregaron mecánicamente (ultra-turrax®) en tres tandas de 10 cada una. A continuación, se centrifugaron durante 10 a 2500 rpm y el sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf para ser sonicado 3 veces durante 10. Posteriormente, el eppendorf fue centrifugado a 9000 g durante 15, obteniendo las proteínas totales en el sobrenadante.
4.2.4. Cuantificación de proteínas totales en los lisados tisulares Con el fin de normalizar la cantidad de proteínas de interés en relación a la cantidad total de proteínas de cada lisado tisular, se procedió a la cuantificación de proteínas totales mediante el método del ácido bicinconínico (Pierce BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific). Brevemente, se añadieron 25 µL de la muestra o estándares a cada pocillo. Se añadieron 200 µL del reactivo de trabajo a cada pocillo y se agitó la mezcla durante 30. Seguidamente, la placa se incubó a 37ºC durante 30 y se midió la absorbancia a 560 nm de cada pocillo en un espectrofotómetro (VICTOR3TM 1420 Multilabel Counter, PerkinElmer). Los valores de absorbancia de cada pocillo de la muestra problema se interpolaron a los valores de la curva patrón. Todas las muestras se analizaron por duplicado.
4.2.5. Cuantificación de las proteínas de interés Cuantificación de PAI-1 en extractos proteicos tisulares y plasma.
La cuantificación de PAI-1 en plasma y extractos proteicos tisulares se llevó a cabo mediante el kit Human Serpin E1/PAI-1 (Cat. no. DY1786, DuoSetTM ELISA, R&D Systems). Brevemente, 100 µL de muestra o estándares se incubaron 2h a temperatura ambiente en una placa de ELISA previamente recubierta con el Anticuerpo de Captura. Tras sucesivos lavados, se añadieron 100 µL de Anticuerpo de Detección a cada pocillo, incubando durante 2 h a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 100 µL de dilución de Estreptavidina-HRP a cada pocillo, incubando durante 20 min a temperatura ambiente, y finalmente, se añadieron 100 µL del sustrato a cada pocillo, incubando 20 min a temperatura ambiente. Tras detener la reacción con 50 µL de solución de parada, la absorción a 450 nm de cada pocillo se midió en un espectrómetro (VICTOR3TM 1420 Multilabel Counter, PerkinElmer). Los valores de absorbancia de cada pocillo de la muestra problema se interpolaron a los valores de la curva patrón. En el caso de los extractos tisulares, los valores obtenidos se normalizaron a pg de PAI-1 /mg de tejido dividiendo por la cantidad de proteína total de cada extracto proteico. Todas las muestras se midieron por duplicado.
Cuantificación de uPA en extractos proteicos tisulares y plasma.
La cuantificación de uPA en plasma y extractos proteicos tisulares se llevó a cabo mediante el kit Human u-Plasminogen Activator/Urokinase Immunoassay (QuantikineR ELISA, R&D Systems). Las muestras de plasma se diluyeron 1:3 en Diluyente de Calibración. Las muestras de tejido se diluyeron 1:3 en Diluyente de Calibración.
Brevemente, se añadieron 100 µL de Diluyente de Ensayo a cada pocillo, seguido de 50 µL de las muestras o estándares, incubando 2h a temperatura ambiente. Tras sucesivos lavados, se añadieron 200 µL del Conjugado Humano de uPA a cada pocillo, incubando 2h a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 200 µL de la Solución Sustrato a cada pocillo, incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras añadir 50 µL de la Solución de Parada, la absorbancia a 450 nm de cada pocillo se midió en un espectrofotómetro (VICTOR3TM 1420 Multilabel Counter, PerkinElmer). Los valores de absorbancia de cada pocillo de la muestra problema se interpolaron a los valores de la curva patrón. En el caso de los extractos tisulares, los valores obtenidos se normalizaron a ng de uPA /mg de tejido dividiendo por la cantidad de proteína total de cada extracto proteico. Todas las muestras se midieron por duplicado.
4.2.6. Extracción ARN total La extracción de RNA total de muestras de tejido se realizó siguiendo el protocolo de extracción de miRNeasy isolation kit (Qiagen). La concentración de RNA en tejido se midió utilizando el Qubit RNA Assay Kit (Invitrogen) en un fluorímetro Qubit 3.0 (Invitrogen) y la pureza mediante el coeficiente de absorbancias A260/A280, usando el NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer . La integridad del RNA total vendrá indicada por el número RIN (RNA Integrity Number) obtenido del estudio de las muestras con el bioanalizador de Agilent.
4.2.7. Cuantificación de la expresión génica de los ARN mensajeros de interés La cuantificación de los ARN mensajeros de interés se realizó mediante la reacción de PCR cuantitativa en tiempo real (RTqPCR) en un termociclador LightCycler 480 II (Roche Diagnostics), utilizando la versión 3.5 software (Roche Molecular Biochemicals).
Se analizó la expresión de 9 genes de interés recogidos en la tabla 12 utilizando sondas de hidrólisis prediseñadas TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies). Como controles endógenos se emplearon los genes de referencia IPO 8 y PUM1.
4.2.8. Cuantificación de los miRNAs maduros de interés: La cuantificación de miRNAs de interés se realizó a partir de RNA total mediante RT-qPCR. En primer lugar, el RNA es retrotranscrito a ADNc mediante mediante una retrotranscripción universal a partir de 10 ng de ARN total, utilizando el miRCURY LNA RT Kit (Qiagen), y siguiendo las instrucciones del fabricante. La posterior PCR en tiempo real se realizó a partir de una dilución 1:60 del ADNc en agua libre de RNasas, empleando SYBR Green y cebadores específicos conteniendo nucleótidos modificados químicamente (LNATM, EXIQON). Brevemente, el ADNc se diluyó 1:60 en agua libre de ARNasa, añadiendo miRCURY SYBR Green Master Mix y cebadores miRCURY miRNA LNA PCR (Qiagen) a una placa de PCR de 384 pocillos en un volumen de reacción final de 10 L. Las reacciones de qPCR se realizaron de la siguiente manera: un ciclo de activación/desnaturalización de la polimerasa de 10 min a 95 ºC seguido de 45 ciclos de desnaturalización de 10s a 95 ºC y 1 min de hibridación/extensión combinada a 56 ºC. Todas las reacciones de RT-qPCR se realizaron en un LightCycler 480 II (Roche). Los valores obtenidos de los miRNA de interés se normalizaron con los niveles del snoRNA U6B.
4.2.9. Análisis estadísticos Los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante el software "Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), versión v21.0 (IBM Corporation), considerando estadísticamente significativo un nivel de p<0.05. El cálculo del número de muestras se realizó mediante la fórmula de comparación de grupos independientes, con análisis de contraste bilateral y errores tipo I y II fijados en 5 % y 20 % respectivamente. Se comprobó la distribución normal de todas las variables continuas mediante la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov. Las variables categóricas se expresan como frecuencia y porcentaje y se compararon con la prueba de Chi-cuadrado o el Test exacto de Fisher. Las variables continuas se expresan como media ± error estándar de la media o mediana y rango intercuartílico. Las diferencias en las variables continuas entre dos grupos se analizaron mediante la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney. La correlación entre variables se calculó mediante el coeficiente de correlación de Pearson o Spearman. Se realizaron modelos de regresión lineal para evaluar la posible influencia de covariables.
5. CONCLUSIONES La ecografía trasvaginal se puede considerar una técnica precisa para realizar el estadiaje local del cáncer de endometrio. En asociación con el TC, la ecografía podría reemplazar a la RM como técnica de imagen de elección para estudio preoperatorio generando un coste económico significativamente menor.
Los parámetros oncológicos obtenidos afirman el adecuado tratamiento de las pacientes con CE en nuestro. Creemos que con el tratamiento adyuvante personalizado según los grupos de riesgo acorde a la clasificación molecular actual el pronostico de las pacientes todavía será mejor.
La ecografía junto con el TC como técnica de imagen para estudio preoperatorio en sustitución a la RM reduce el coste económico de forma considerable.
El abordaje mínimamente invasivo en el tratamiento de cáncer de endometrio ofrece los resultados óptimos en términos de recuperación temprana, funcionalidad, mínimo número de las complicaciones y menor estancia hospitalaria proporcionando a las pacientes mejor calidad de vida.
6. BIBLIOGRAFÍA International Agency for Research on Cancer. GLOBOCAN 2020. https://gco.iarc.fr Oncoguía SEGO Cáncer de endometrio 2023.
Oncoguía SEGO Cáncer de endometrio 2016.
Bast RC, Feeney M, Lazarus H, Nadler LM, Colvin RB, R C Knapp RC. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J Clin Invest 1981. 68(5):1331 Brennan DJ, Hackethal, Metcalf AM, Coward J, Ferguson K, Oehler MK, Quinn MA, Janda M, Leung Y, Freemantle M, Webb PM, Spurdle AB, Obermair A. Serum HE4 as a prognostic marker in endometrial cancer - A population based study. Gynecol Oncol. 2014. 132(1):15965.
Kalogera E, Scholler N, Powless C, Weaver A, Drapkin R, Li J, Jiang Sh-W, Podratz K, Urban N, Dowdy SC. 2012. Correlation of Serum HE4 with Tumor Size and Myometrial Invasion in Endometrial Cancer. Gynecol Oncol. 124(2):27075.
Bie Y, Zhang Z. Diagnostic value of serum HE4 in endometrial cancer: a meta-analysis. World J Surg Oncol. 2014; 12: 169.
Alcázar JL, Gastón B, Navarro B, Salas R, Aranda J, Guerriero S. Transvaginal ultrasound versus magnetic resonance imaging for preoperative assessment of myometrial infiltration in patients with endometrial cancer: a systematic review and meta-analysis. J Gynecol Oncol. 2017. 28(6):e86.
Akbayir O, Aytul Corbacioglu A, Numanoglu C, Guleroglu FY, Ulker V, Akyol A, Guraslan B, Odabasi E. Preoperative assessment of myometrial and cervical invasion in endometrial carcinoma by transvaginal ultrasound. Gynecol Oncol. 2011 Sep;122(3):600-3.
Haldorsen I. & Salvesen H. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer Curr Oncol Rep (2016) 18: 25.
Arraras JI, Martinez M, Manterota A, Lainez N. La evaluación de la calidad de vida del paciente oncológico. El grupo de calidad de vida de la EORTC. Psicooncología. 2204. 1 (1): 87-98.
World Medical Association. JAMA. 2013;310(20):2191-4.
