La DNA Topoisomerasa I como nueva diana de antibióticos

• Autores: Míriam García López
• Directores de la Tesis: María José Ferrándiz Avellano (dir. tes.), Adela M. González de la Campa (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2024
• Idioma: español
• Número de páginas: 183
• Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Puyet Catalina (presid.), José Antonio Escudero García-Calderón (secret.), Silvia Ayora Hirsch (voc.), Susana Seseña Prieto (voc.), José Enrique Yuste Lobo (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Microbiología y Parasitología por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    Streptococcus pneumoniae es el principal agente etiológico de neumonía adquirida en la comunidad y la causa más común de neumonía bacteriana en niños. Coloniza la nasofaringe del 27-65 % de los niños y del 10 % de los adultos. La prevención de las infecciones por S.

    pneumoniae se basa en la vacunación frente a los principales serotipos que las causan. El tratamiento de estas infecciones se ve dificultado por la aparición de resistencias a los antibióticos beta-lactámicos, macrólidos y fluoroquinolonas (FQs). Es de gran importancia la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos. Las DNA topoisomerasas son dianas de compuestos antimicrobianos.

    Existen dos tipos de DNA topoisomerasas, las de tipo I, que introducen un corte en una de las hebras del DNA, y las de tipo II, que cortan ambas hebras. En S. pneumoniae la DNAgirasa (girasa, tipo II) y la topoisomerasa I (TopoI, tipo I) son las principales responsables del mantenimiento del superenrollamiento del DNA (SE). Las FQs actúan inhibiendo las enzimas de tipo II, provocando alteraciones en el nivel de SE e inhibiendo el crecimiento bacteriano.

    No existen compuestos inhibidores de las topoisomerasas de tipo I de uso clínico. En esta Tesis Doctoral se estudia la TopoI de S. pneumoniae como nueva diana de antibióticos. Se cuantificó el número de moléculas por célula de TopoI y girasa en cepas con expresión de topA bajo el control de un promotor inducible, estudiando el efecto de su variación sobre el nivel de SE y el crecimiento. La proporción entre TopoI y girasa se correlacionó con el nivel de SE, estimado mediante electroforesis bidimensional de topoisómeros plasmídicos en geles de agarosa, para determinar la densidad de SE, y microscopía confocal de superresolución, para determinar el nivel de compactación del nucleoide bacteriano. La ratio girasa:TopoI fue dependiente de la inducción de la expresión de topA por ZnSO4, variando entre 1:1,26 y 1:0,86 en condiciones de viabilidad; los bajos niveles de TopoI en ausenciade ZnSO4 dieron lugar a una mayor proporción (1:0,09) asociada a hiper-SE del DNA y letalidad. La inhibición de la girasa, mediante el tratamiento con novobiocina (NOV), restableció el crecimiento celular en ausencia de ZnSO4, asociándose a una relajación del DNA. Estos resultados sugieren que la proporción entre girasa y TopoI, que se encuentra regulada en la célula, determina los niveles de SE, la compactación del nucleoide y la viabilidad bacteriana.

    Además, se caracterizó la actividad enzimática de una proteína TopoI mutante, estudiándose el efecto de su producción controlada sobre el crecimiento, la sensibilidad a antibióticos, el nivel de SE y la transcripción. La proteína mutante TopoIRA presentó in vitro una actividad enzimática 20 veces menor a la de la proteína silvestre y una resistencia a la inhibición por el compuesto seconeolitsina 2 veces mayor. El estudio del efecto de la mutación sobre la actividad in vivo se llevó a cabo mediante la inducción controlada del alelo topARA en una cepa que permite una sobreproducción moderada (2 veces) bajo el control de PZn, y otra que permite una elevada sobreproducción (9 veces) bajo el control de PMAL. La sobreproducción de TopoIRA aumentó el tiempo de generación, confirió una mayor resistencia a seconeolitsina, y, en presencia de NOV, dio lugar a una menor relajación del DNA. La sobreproducción en presencia de NOV dio lugar a una respuesta transcriptómica organizada en dominios topológicos equivalente entre ambas proteínas, afectando aproximadamente a un 52 % del genoma, acompañada de un alto nivel de relajación del DNA. Estos resultados apoyan la importancia del equilibrio entre las actividades de la girasa y la TopoI en el mantenimiento del SE, la compactación del nucleoide y la viabilidad de S. pneumoniae; así como el papel de la TopoI en la transcripción global y su idoneidad como diana de compuestos antibióticos.

  • English

    Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an opportunistic pathogen that colonises the nasopharynx of a high percentage of the population, more commonly in children (27-65 %) than adults (<10 %). This colonisation can lead to community transmission and progression to invasive pneumococcal disease. It is the major aetiological agent of community-acquired pneumonia and the most common cause of bacterial pneumonia in children. Prevention of S. pneumoniae infections is based on vaccination against the major serotypes that cause them. Treatment of these infections is hampered by the emergence of resistance to β-lactam, macrolide and fluoroquinolone (FQs) antibiotics. Finding new therapeutic targets and developing new antimicrobial compounds is therefore essential...