Nuevos abordajes para la caracterización del sistema inmune y de las vesículas extracelulares derivadas de hepatocitos en ratones reporteros de linaje celular con y sin daño hepático

• Autores: Elena Blázquez López
• Directores de la Tesis: Francisco Javier Vaquero Martin (dir. tes.), Rafael Correa Rocha (dir. tes.), Rafael Bañares Cañizares (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2024
• Idioma: español
• Número de páginas: 214
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Cubero Palero (presid.), Juan José García Rodríguez (secret.), Miguel Relloso Cereceda (voc.), Juan Manuel Falcon Perez (voc.), Alberto Davalos Herrera (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Investigación Biomédica por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Fisiología humana
      • Fisiología de la digestión
    • Inmunología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    El daño hepático inducido por paracetamol (APAP) es la causa más frecuente de insuficiencia hepática aguda en países desarrollados. Actualmente, no existen biomarcadores predictivos o de diagnóstico temprano precisos. El sistema inmunológico y las vesículas extracelulares (VEs) podrían aportar información útil sobre el estado del hígado de manera no invasiva, pero su investigación en modelos murinos tiene importantes limitaciones. Los objetivos del presente trabajo fueron diseñar y validar estrategias de análisis del sistema inmune y de aislamiento y trazabilidad de VEs derivadas de hepatocitos utilizando la cepa de ratón reportera de linaje celular AlbCre x mT/mG, así como caracterizar las alteraciones inducidas por el daño hepático agudo por APAP sobre el perfil inmunológico y las VEs derivadas de hepatocitos. Para ello, utilizamos ratones C57BL/6 (WT), deficientes de interleuquina 10 (IL-10 KO), mT/mG y AlbCre x mT/mG, estos últimos con expresión de EGFP en la membrana de los hepatocitos y de tdTomato en el resto de tipos celulares. Para evaluar el sistema inmune murino, diseñamos 2 paneles de anticuerpos para citometría de flujo multiparamétrica utilizando un volumen mínimo de sangre. Respecto al análisis de las VEs, comparamos las técnicas de aislamiento ultracentrifugación (UC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y selección inmuno-magnética frente a las tetraspaninas (EXOKIT) o frente a GFP, tanto en medio de cultivo de hepatocitos primarios como en muestras de plasma de ratón con o sin daño hepático agudo inducido por Jo2 o por APAP. Las diferentes fracciones obtenidas se analizaron mediante citometría de flujo, Nanoparticle Tracking Analysis, microscopía electrónica de transmisión y Western Blot. Los paneles de anticuerpos diseñados permitieron analizar 35 fenotipos de la respuesta inmune innata y adaptativa murina en 100 ml de sangre. Comparado con los ratones WT, los ratones IL-10 KO mostraron un descenso de los linfocitos con un aumento de la proporción de células T CD4+ y CD8+ activadas y T helper 17 (Th17), y un aumento de la proporción de células mieloides, en concreto de neutrófilos, monocitos y células dendríticas proinflamatorias. Las VEs liberadas por hepatocitos primarios mantuvieron la expresión de las proteínas fluorescentes correspondiente a la cepa de ratón de origen, permitiendo identificar las VEs derivadas de hepatocitos en el plasma de la cepa AlbCre x mT/mG. Tanto los ensayos in vitro como in vivo determinaron la UC, de forma individual y en combinación con microbeads anti-GFP, como el método más eficiente para aislar VEs (FM4-64+) EGFP+ con un mayor enriquecimiento de exosomas (CD81+) y menor contaminación de cuerpos apoptóticos (AnnV+). Los ratones AlbCre x mT/mG con daño hepático agudo inducido por APAP presentaron una importante disminución de linfocitos circulantes, aunque con aumento de los fenotipos CD4+ y CD8+ activados y Th17, y un aumento de los neutrófilos. El daño por APAP aumentó la concentración de VEs tanto in vitro como in vivo. El incremento de VEs en plasma se produjo a expensas de VEs EGFP+, es decir, procedentes de hepatocitos. Entre los diversos órganos de los ratones AlbCre x mT/mG, sólo las células del pulmón mostraron un aumento de la señal EGFP+ tras el daño por APAP. En conclusión, los nuevos paneles de anticuerpos permitieron la evaluación exhaustiva del sistema inmune murino en sangre con supervivencia del animal, detectando diferencias entre ratones WT e IL-10 KO o con daño hepático por APAP. Las VEs aisladas del ratón AlbCre x mT/mG conservan la fluorescencia de la célula de origen. La combinación de UC y microbeads anti-GFP consiguió el mejor balance entre concentración y pureza para el aislamiento de VEs EGFP+ del plasma. El daño hepático agudo por APAP en ratones indujo: i. alteraciones de diversas poblaciones inmunes en sangre, y ii. un marcado aumento de las VEs circulantes derivadas de hepatocitos, siendo el pulmón su principal órgano de destino

  • English

    The syndrome of acute liver failure (ALF) consists of the rapid deterioration of liver function in the absence of underlying chronic liver disease. Among its possible etiologies, drug-induced liver injury (DILI), particularly the one due to acetaminophen (APAP), is the most prevalent cause in developed countries. Unfortunately, there are no predictive or early diagnostic biomarkers that allow us to accurately predict the development of the most severe symptoms or to implement early treatments. The immune profile and the extracellular vesicles (EVs) represent possible sources of biomarkers that can be obtained quickly and non-invasively from the patient. The investigation of both sources in murine experimental models, however, is hindered by relevant limitations, such as the absence of protocols that allow a broad and repeated study over time in the case of circulating immune cells or, in the case of Evs, the existence of problems related to the standardization of isolation protocols, the determination of the cell type of origin in living organisms, or the study of the biodistribution of Evs from specific cell types...