Contribución del catabolismo de I-prolina a la respuesta hipersensible

• Autores: Mariela Inés Monteoliva
• Directores de la Tesis: María Elena Álvarez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2012
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    La Respuesta Hipersensible (HR) es un programa de defensa vegetal que confiere resistencia contra patógenos biótrofos. Esta respuesta se caracteriza por la generación de desbalances rédox, inducción de genes de defensa y muerte celular programada de las células infectadas. Estudios recientes del grupo revelaron que el metabolismo de L-prolina (Pro) se encuentra alterado durante el desarrollo de la HR y demostraron que la enzima limitante en la degradación de Pro a Glu, Pro deshidrogenasa (ProDH), potencia la acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS), la muerte celular y la resistencia asociadas a la HR. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual ProDH ejerce tales efectos.

    En este trabajo se analizan dos posibles contribuciones de ProDH a la HR, la acumulación del intermediario tóxico A'-pirrolina-5-carboxilato (P5C) así como también la participación de la enzima en el ciclo Pro/P5C que genera ROS a nivel mitocondrial. Se analizaron niveles de aminoácidos, actividad ProDH in vivo e in vitro, acumulación de ROS, muerte celular y expresión de genes en tres etapas de la HR. Se describe el aumento de la actividad de ProDH y la oxidación completa de Pro a Glu previo al inicio de la muerte (Fase 1), que preceden a la activación del ciclo Pro/P5C, acumulación de ROS y estimulación de muerte celular (Fase II). Además, se detectó activación de la síntesis de Pro en el estadio final de la HR (Fase III), donde recién se pudo observar acumulación de P5C.

    Utilizando mutantes del catabolismo de Pro que evitan su oxidación a Glu por falta de la segunda enzima de la degradación, P5C deshidrogenasa (P5CDH; mutantes p5cdh), se analizó la regulación del ciclo Pro/P5C por la actividad de dicha enzima. Estas mutantes, activan el ciclo Pro/P5C desde la Fase 1, y muestran mayor acumulación de ROS y muerte, así como un incremento transitorio de la resistencia al patógeno. Además, se caracterizaron mutantes que interrumpen el ciclo Pro/P5C por falta de la segunda enzima de síntesis, P5C reductasa (P5CR; mutantes p5cr) para evaluar el efecto del ciclo sobre la HR. Se observó que estas mutantes presentan una acumulación precoz de P5C asociada a mayores niveles de muerte celular en HR. Por último, se evaluó el impacto del catabolismo de Pro en los metabolismos de otros aminoácidos en HR, detectándose cambios en niveles de GABA, Gln, His y Ala, cuyo efecto sobre la defensa resta ser caracterizado.

    En conclusión, este trabajo permitió determinar que ProDH potencia la muerte en HR mediante la activación del ciclo Pro/P5C. Asimismo describimos que P5CDH seria un factor clave en la regulación del mismo, permitiendo o impidiendo su activación por el consumo de P5C.

  • English

    The Hypersensitive Response (HR) is a plant defense program that confers resistance against biotrophic pathogens. This response is characterized by the generation of a redox imbalance, the induction of defense genes and consequent programmed ce!l death of the attacked celis. Our group studies recently revealed that L-proline (Pro) metabolism is altered during HR development and showed that Pro dehydrogenase (ProDH), the rate limiting enzyme in the degradation of Pro to Glu, enhances the accumulation of reactive oxygen species (ROS), ccli death and HR-associated resistance (Cecchini et al., 2011a). However, the mechanism by which ProDH promote this changes is still unknown. In this work we analyzed two possible contnbutions of ProDH to HR: i) the accumulation of toxic intermediate P5C; ji) the participation of the enzyme in the Pro/P5C cycle that generates ROS at the mitochondrial leve!. We analyzed amino acid leveis, ProDH activity in vivo and in vitro accumulation of ROS, celi death, and defense gene expression in three stages of HR. We found that the increased activity of ProDH and complete oxidation of Pro to Glu precedes the onset of death (Phase 1), and is foliowed by the activation of Pro/P5C cycle, with concomitant ROS accumulation and stimulation of celi death (Phase II). Finaily, we detected Pro synthesis activation in the final stage of the HR (Phase III), where P5C accumulation was observed. Using Pro catabolic mutants that prevent oxidation to Glu because they lack the second enzyme of catabolic pathway, A'-pyrroiine-5-carboxylate dehydrogenase (P5CDH; p5cdh mutants) was analyzed the reguiation of the Pro/P5C cycle by this enzyme. These mutants activated the cycle Pro/P5C from Phase 1, showed increased accumulation of ROS and death, and a transient increase in pathogen resistance. In addition, we characterized mutants that lack the second enzyme of the synthesis, A l -pyrroline-5-carboxylate reductase (P5CR; p5cr mutant) thus disrupting the cycle Pro/P5C to evaluate the effect on the HR. We observed that these mutants exhibit eariy P5C accumulation associated with higher ievels of ccii death in HR. Finaily, we assessed the impact of Pro catabolism in the metabolism of other amino acids during the onset of HR, detecting changes in ieveis of GABA, Gin, His and Ala, whose effects on defense remains to be characterized. In conclusion, our studies indicate that ProDH potentiates HR by activating Pro/P5C cycle. We also describe that P5CDH wouid be a key factor in the regulation of this cycle, allowing or preventing its activation through P5C consumption.