Estructura y diversidad de comunidades bacterianas reductoras de nitrato del río Suquía

• Autores: Luciana Reyna
• Directores de la Tesis: Susana Del Valle Genti de Raimondi (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2012
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    El río Suquía es uno de los cursos de agua más importantes de la región centro-pampeana argentina en la provincia de Córdoba. El ecosistema que representa sufre un continuo deterioro que se refleja en la calidad de sus aguas y en su biodiversidad, producto del asentamiento de numerosas poblaciones a lo largo de toda su cuenca. En este trabajo de tesis se evaluó la población bacteriana reductora de nitrato de sedimentos del río Suquía a través del estudio del gen narG que codifica a la subunidad catalítica de la enzima NarGHI, la reductasa de nitrato unida a membrana. Dicha proteína está presente en un gran número de filos procariotas y su gen resulta de gran utilidad para el análisis de los organismos que participan en una de las principales transformaciones dentro del ciclo del nitrógeno. A través del análisis de perfiles de restricción del gen narG presente en muestras de DNA genómico de sedimentos del río y la construcción de bibliotecas de clones del mismo gen se demostró que las comunidades bacterianas reductoras de nitratos del río Suquía poseen una conformación particular y característica en los distintos puntos de la cuenca media-baja, con similitudes en su estructura entre sitios adyacentes a lo largo del río. Se observó que en La Calera, un sitio de baja contaminación, hay mayor dominancia de secuencias narG relacionadas a beta- y alfa-proteobacterias. En Río Primero, donde la calidad del agua es menor, existe mayor diversidad de estas secuencias y una distribución más homogénea entre los distintos grupos filogenéticos. Es relevante el hallazgo de secuencias narG novedosas, con bajos valores de identidad hacia las secuencias antes descriptas por otros autores, a excepción de las provenientes de una planta de tratamiento de aguas residuales recientemente incorporadas a la base de datos GenBank. Dichas secuencias, que pertenecen a la biblioteca de clones del punto de muestreo de Río Primero, se clasificaron como grupo 111 dentro del árbol filogenético confeccionado a partir de alineamientos de las secuencias de fragmentos narG aislados de las bibliotecas y de numerosos organismos cultivados y no cultivados. Dada la existencia de nuevas secuencias narG (grupo ifi) y su aparente exclusividad con relación a los ambientes en que se encuentran, se diseñó un método de cuantificación de genes por PCR a tiempo real. Su aplicación permitió 6 RESUMEN determinar que el número de copias del gen narG del grupo III es variable a lo largo de la cuenca media-baja del río Suquía. Se observaron valores por debajo del límite de detección en los puntos de baja y media contaminación, La Calera e Isla de los Patos, y niveles máximos en Bajo Grande donde se encuentra la Estación Depuradora de Aguas Residuales (EDAR) Bajo Grande. Tales valores disminuyen aguas abajo al mismo tiempo que la contaminación, correlacionando con el índice de calidad de agua (ICA) en cada punto. Por el contrario, se observó que la población bacteriana reductora de nitrato general no es sensible a los cambios en la calidad del agua del río. Los valores obtenidos indican que sólo en Bajo Grande y Corazón de María el grupo de secuencias narG ifi representan el 10% de todas las secuencias narG de tales puntos, mientras que en Capilla de los Remedios y Río Primero, sitios contaminados en menor grado que los dos anteriores, constituyen muy bajas proporciones. Análisis realizados en distintas épocas del año, incluyendo las temporadas seca y húmeda, señalan que las comunidades bacterianas reductoras de nitrato de los sedimentos del río Suquía tienden a mantener su conformación en tiempos cortos (un año), sin diferenciarse durante las temporadas húmedas y secas. La cuantificación del gen narG del grupo ifi mostró una correlación positiva con la calidad del agua del río en los distintos puntos analizados, pero sin cambiar significativamente entre temporadas mientras que el ICA sí lo hace. El número de copias del gen narG del grupo LII se mantuvo constante en Corazón de María durante el período de tiempo estudiado, mientras que en puntos aguas abajo, más alejados de la planta depuradora de residuos cloacales, este número fue aumentando, coincidiendo con la degradación de estos ambientes en los últimos años. Finalmente, se realizaron ensayos preliminares que simulan el impacto que produciría en las comunidades bacterianas un aumento en la concentración de nitrato sobre sedimentos de La Calera y Río Primero. Tales experimentos indicaron que las distintas comunidades de organismos son capaces de reaccionar de manera diferente ante los cambios en el ambiente, tal como lo señalaron las concentraciones de amoníaco, nitrito y nitrato. Este trabajo representa el primer estudio de la diversidad bacteriana que participa en la reducción del nitrato, reacción de gran importancia dentro del ciclo del nitrógeno, en el río Suquía e intenta comprender qué factores alteran las estructuras bacterianas.

  • English

    Suquía River is one of the most important rivers of the central-pampean Argentinean region in the province of Córdoba. This ecosystem is in constant deterioration as a reflection of the settlement of many populations throughout the basin, which is manifested by the decline in the water quality and biodiversity.

    In this thesis, the nitrate-reducing bacteria¡ populations of Suquía river sed iments were evaluated through the study of the narG gene, which encodes the catalytic subunit of the enzyme NarGHI, the membrane-bound nitrate reductase.

    This protein is present in numerous prokaryotic phyla, and its gene is useful for the analysis of microorganisms involved in one of the major transformations within the nitrogen cycle.

    Analysis of narG gene restriction fragment length polymorphism using genomic DNA samples obtained from sediments and the construction of done libraries were performed. These data indicate that Suquía River nitrate-reducing bacteria¡ communities have a particular and characteristic conformation at different points of the lower and middle basin. Similarities in adjacent sites structures between along the river were found. Greater dominance of narG sequences related to beta- and alpha-proteobacteria in La Calera, a low-pollution site, was observed, while in Río Primero, where water quality is lower, there was greater diversity of narG sequences and more even distribution among the different phylogenetic groups.

    Interestingly, novel narG sequences were found, which have low identity to sequences previously described by other authors, except for few sequences from a treatment plant wastewater recently added to GenBank database. A phylogenetic tree was constructed from alignments of narG sequence fragments isolated from the libraries and numerous cultivated and non-cultivated bacteria. These novel narG sequences, which belong to the library of Río Primero sampling point clones, were classified as group m in the phylogenetic tree.

    Given the existence of new narG sequences (group III) and its apparent exclusivity in relation to environments in which they are present, a method to quantify narG copies by real time PCR was designed. This method allowed us to determine that the narG gene copy number of group ifi is variable along the lower and middle basin of the river Suquía. Values below the detection limit in La Calera and Isla de los Patos, points of low and mid pollution, and maximum levels in Bajo Grande, where Bajo Grande wastewater treatment plant is located were found.

    These values decrease downstream at the same time as pollution, corresponding with water quality index (WQI) at each point. Qn the contrary, total nitratereducing bacteria¡ population is not sensitive to changes in the quality of river water. The values obtained indicate that narG sequences of group ifi represent 10% of ah narG sequences in Bajo Grande and Corazón de María; while in Capilla de los Remedios and Río Primero, which are less contaminated sites, narG sequences of group III represent very low proportions.

    Analyses carried out at different times of year indicate that nitrate-reducing bacteria¡ communities in Suquía river sediments tend to conserve their conformation during a short time (one year). No difference between wet and dry seasons was estabhished. Quantification of the group 111 narG gene copies showed once again that copy number of this gene correlate with the quality of river water in the sampled points, but it does not change significantly between seasons, while the ICA does. The copy number of the group iri narG gene was constant at Corazón de María over this period of time, while at points furthest downstream from the sewage treatment plant, this number increased coinciding with the recognized degradation in such environments over recent years.

    Finahly, preliminary tests were conducted to simulate the impact produced by an increase in nitrate concentration on sediments from La Calera and Río Primero over bacteria¡ communities living there. These experiments indicated that different communities of organisms are able to react distinctly to changes in the environment, as noted by the concentrations of ammonia, nitrite and nitrate.

    This work represents the first study on bacterial diversity of Suquía River related to nitrate reduction, a reaction of major importance in the nitrogen cycle, and attempts to understand what factors alter the bacteria¡ structures.