Determinantes de localización subcelular de proteínas transmembrana

• Autores: Rodrigo Quiroga
• Directores de la Tesis: Hugo José Maccioni (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2013
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    En la actualidad, aún existen numerosos interrogantes sobre los mecanismos y determinantes moleculares que definen que algunas proteínas que transitan la vía exocítica sean retenidas en el Aparato de Golgi (AG) mientras que otras continúen su camino hacia la membrana plasmática (MP). En esta tesis realizamos análisis bioinformáticos sobre centenares de secuencias de proteínas transmembrana tipo II que nos permitieron hipotetizar que el largo del dominio transmembrana (TMD) y el volumen de los aminoácidos que componen el hemi-TMD exoplásmico determinan la localización subcelular estable en AG o MP, sin necesitar de la presencia de señales aminoacídicas presentes en el tallo citosólico. Esta hipótesis se comprobó experimentalmente utilizando como modelo dos proteínas de Saccharomyces cerevisiae, la SNARE Sftl, que localiza al AG, y la SNARE Ssol, que localiza en MP. Modificamos el largo de sus TMDs y el volumen de sus hemi-TMD exoplásmicos, generando una colección de 18 constructos SNARE con TMDs quiméricos y determinamos su localización subcelular en células de levadura y en células de ovario de hámster chino (CHO-K1). Los experimentos de localización subcelular indican que los TMDs cortos y voluminosos en la mitad exoplásmica confieren localización subcelular estable en el AG, mientras que los TMDs largos y/o poco voluminosos en la mitad exoplásmica permiten la exportación de estas proteínas desde el AG y confieren localización en la MP. En conjunto, nuestros resultados indican que existen mecanismos de localización subcelular mediados por el TMD que se encuentran conservados a lo largo del dominio Eukarya, y que estos mecanismos son críticos para la localización en AG o MP de una gran mayoría de las proteínas transmembrana tipo H. Interacciones moleculares entre los TMDs y los lípidos de la membrana del AG podrían generar dominios lipídicos de alta curvatura, enriquecidos en colesterol, esfingolípidos y proteínas de MP (dominio de exportación), y dominios lipídicos de baja curvatura, enriquecidos en proteínas del AG, empobrecidos en colesterol y esfingolípi dos. Los resultados sugieren que los TMDs de proteínas de MP podrían ser concentrados en dominios de exportación del AG, sin la necesidad de ser seleccionadas y concentradas por un mecanismo activo, como ocurre en los pasos de tráfico vesicular mediados por cubiertas proteicas.

  • English

    It is still unclear why sorne proteins that travel along the secretory pathway are retained in the Golgi complex (GC) while others follow their way to the plasma membrane (PM). In this thesis we perform bioinformatic analyses on a large number of single spanning type II membrane proteins which support the hypothesis that specific features of the TransMembrane Domain (TMD) are relevant to the sorting of these proteins to the Golgi complex or the PM. Moreover, TMDs are capable of deterrnining subcellular localization regardless of aminoacidic signals present in the cytoplasmic domains of type II proteins. These hypothesis were experimentally tested using the Golgi SNARE Sftl and the PM SNARE Ssol from Saccharomyces cerevisiae as rnodel proteins. We modified the Iength of their TMDs and the volume of their exoplasmic hemi-TMD, and determined their subcellular localization in both yeast and marnmalian cells. We found that short TMDs with voluminous exoplasmic hemiTMDs confer Golgi membrane residence, while TMDs having Iess voluminous exoplasmic hemi-TMDs, and/or long TMDs, confer PM residence to these proteins. Results indicate that the volume of the amino acids which conform the exoplasmic hemi-TMD, in addition to the length of the entire TMD, determine retention in the Golgi or exit to the PM of Type II membrane proteins.

    In conclusion, our results indicate that TMD mediated subcellular localization mechanisms are conserved throughout the Eukarya, and these mechanisms are critica¡ for correct localization in the GC or PM for most type II transmembrane proteins. Considering our results, we suggest differential lateral segregation of TMDs with different characteristics upon the Golgi membrane is an emerging property which arises from the molecular interactions occurring between the complex mix of components present on the membrane of the GC. Lipids and TMDs would tend to segregate into at least two domains. Export domains, with high curvature rnembranes, enriched with PM protein TMDs, cholesterol and sphyngolipids. Processing domains, with low curvature membranes, enriched with GC protein TMDs, and low concentrations of cholesterol and sphyngolipids. This would produce TMD-lipid interaction based sorting, which would concentrate PM proteins in export domains without the need to be selected and concentrated by an active mechanism, as occurs with coat-based vesicular transport steps.