Análisis molecular de la restauración de p53 por quercetina en células de cáncer cervicouterino vph positivas y su implicación en el arresto del ciclo celular

• Autores: Aldo Francisco Clemente Soto
• Directores de la Tesis: Leticia González Maya (codir. tes.), Oscar Peralta Zaragoza (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma del Estado de Morelos ( México ) en 2018
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: riaa.uaem.mx
• Resumen
  • español

    Objetivo. Este estudio tuvo la finalidad de aportar conocimiento al mecanismo del efecto citotóxico de quercetina en células de cáncer cervicouterino HeLa y SiHa, particularmente, en la inducción del arresto celular y apoptosis, asociado a la activación de p53, independientemente de la expresión de la oncoproteína E6 VPH. Metodología. Se ensayó la citotoxicidad de quercetin en células HeLa y SiHa por MTS, además de su impacto en el ciclo celular por citometría. La apoptosis se evaluó por microscopía, actividad de caspasas, y molecularmente por la relación de la expresión Bax/Bcl-2 por western blot. Particularmente se analizó la expresión de p53 por western blot y su localización celular por microscopía confocal. La actividad de p53 se investigó mediante la expresión algunos de sus blancos transcripcionales, por western blot o RT-PCR. Además, se evaluó la expresión de E6 VPH por western blot. Finalmente, se predijo computacionalmente, la unión de quercetina a E6 VPH. Resultados. Los resultados revelaron que la toxicidad de quercetina involucró arresto celular en la fase G2 e inducción de apoptosis a tiempos más tardíos. Identificamos que quercetina incrementó la proteína total de p53 y su localización nuclear. Así mismo, quercetina aumentó la expresión de los blancos transcripcionales de p53, p21 y Bax, sugiriendo la activación transcripcional de p53 y su rol en ciclo celular y apoptosis. Interesantemente, la activación de p53 en células HeLa y SiHa, no involucró cambios de expresión de E6 VPH, el regulador negativo de la expresión de p53 en células de cáncer cervicouterino infectadas por VPH, lo que supone un efecto de quercetina sobre la actividad de E6. Esta noción es apoyada por el ensayo computacional que predijo que quercetina se une a residuos claves de E6 VPH para la formación del complejo E6/E6AP, y por lo tanto, la degradación de p53. Conclusión. Quercetina induce arresto en la fase G2, seguido de apoptosis, en células HeLa y SiHa, posiblemente a través de la activación de p53, derivado del impedimento de la formación del complejo E6/E6AP. Aportación. Este estudio aporta conocimiento sobre las acciones moleculares y celulares de quercetina en las células de cáncer cervicouterino HeLa y SiHa. Además, propone que quercetina es una molécula con interesantes actividades biológicas que deberían ser exploradas a fondo.

  • English

    Objective. The aim of this study was to contribute knowledge to the cytotoxic mechanism of quercetin in cervical cancer cells, HeLa and SiHa, mainly in cell cycle arrest and apoptosis, associated with the activation of p53 which resulted independent of the expression of HPV E6 ocoproteín. Methods. The cytotoxicity of quercetin in HeLa and SiHa cells was tested by MTS. The effect of quercetin on the cell cycle was assessed by cytometry and by the rate of mitotic nuclei. Apoptosis was tested by microscopy, by caspases activity, and by measuring the Bax/Bcl-2 ratio. The expression of total p53 protein was analyzed by western blot, while, its cellular localization it was try out by confocal microscopy. We also investigated the expression of transcriptional targets of p53, by western blot or RT-PCR. The expression of HPV E6 was evaluated by western blot. The binding between quercetin and HPV E6 was predicted by molecular docking. Results. The results revealed that the toxicity of quercetin involved G2 phase cell arrest and triggering of apoptosis at later times. We identified that quercetin increased the total p53 protein and its nuclear signal. Likewise, quercetin increased the expression of the p53 targets genes, p21 and Bax, suggesting the transcriptional activation of p53 and its role in cell cycle and apoptosis. Interestingly, the activation of p53 in HeLa and SiHa cells did not involve changes of the E6 HPV expression, the negative regulator of p53, which presumes an effect of quercetin on the activity of E6, rather than on its expression. This assumption is supported by the molecular docking assay that predicted quercetin binds to key HPV E6 residues in the formation of the E6 / E6AP complex, and therefore, the degradation of p53. Conclusion. Quercetin causes G2 arrest, followed by apoptosis in HeLa and SiHa cells, possibly through the activation of p53, derived from disrupting of the E6/E6AP complex formation. Contribution. This study provides knowledge about the molecular and cellular actions of quercetin in HeLa and SiHa cervical cancer cells. In addition, it proposes that quercetin possess interesting activities that should be thoroughly explored.