Estudios celulares y moleculares de la neovascularización retinal en mamíferos. Participación del sistema IGF-1/IGF-1R

• Autores: Valeria Erika Lorenc
• Directores de la Tesis: María Cecilia Sánchez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2014
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    IGF-1 es un factor de crecimiento que ejerce efectos mitogénicos, de diferenciación, anti-apoptóticos y metabólicos sobre diferentes tipos de células pero también participa en procesos patológicos como la neovascularización (NV) retinal, la cual se encuentra asociada a una excesiva proteólisis de la matriz extracelular (MEC). A nivel de la retina, diferentes enfermedades como la Retinopatía del Prematuro (ROP) y la Retinopatía Diabética Proliferativa (RDP) involucran la NV que puede provocar, en etapas finales de las mismas, la reducción parcial o total de la visión. Se conoce que la hipoxia, principal desencadenante de estas patologías, produce fundamentalmente un desbalance entre factores pro-angiogénicos (VEGF, IGF-1, bFGF, PDGF) y anti-angiogénicos (PEDF, TGF-, Angiostatina, TIMP) que culmina con la NV, siendo este mecanismo en la actualidad el mejor estudiado. Sin embargo, la participación de otros factores independientes de hipoxia como IGF-1, al presente no ha sido completamente esclarecida.

    Si bien las retinopatías fueron clásicamente consideradas como una enfermedad vascular, evidencias más recientes indican que es también una enfermedad neurodegenerativa, por lo cual más de un tipo celular retinal se ven afectados en este proceso. Al respecto, las células gliales de Müller (CM) que tienen un rol crítico en el mantenimiento de la homeostasis del espacio extracelular así como en la conservación de la integridad de la barrera hemato-retiniana, merecen especial atención en la NV. Su asociación con los vasos retinales así como la capacidad de sintetizar factores como VEGF y metaloproteinasa (MMPs) dejan implícita la relación que existe entre las CM y el desarrollo tanto fisiológico como patológico de la NV retinal. Evidencias preliminares de nuestro laboratorio indican que IGF-1R está altamente expresado en las CM y que bajo estímulo con IGF-1 es capaz de regular la actividad de MMPs, sugiriendo que el sistema IGF-1/IGF-1R participaría en la regulación el complejo proceso de NV en la retina. Por lo cual, el principal interés de esta Tesis fue investigar el efecto de IGF-1 y su receptor sobre la actividad proteolítica extracelular asociada a eventos de migración celular en diferentes modelos experimentales.

    Para ello, en primer lugar utilizando como modelo experimental in vitro la línea de células gliales humana MIO-M1 demostramos por ensayos de Western blot que IGF-1, al interaccionar con su receptor, promueve la fosforilación del mismo así como la activación de las vías de señalización MAPK/ERK y PI3K/AKT de manera selectiva. A continuación y con el objeto de explorar los efectos de IGF-1 sobre la activación MMPs, se realizaron ensayos de zimografía con los sobrenadantes de 2 células MIO-M1 estimuladas con el factor observándose una disminución relativa de la forma activa de MMP-2, respecto a la obtenida en las células sin estímulo. Esta regulación de la actividad en los sobrenadantes se correlacionó con un incremento en MMP-2 a nivel de lisado celular. Además esta regulación demostró ser mediada por la via de señalamiento intracelular PI3K/AKT. Finalmente, por ensayos de inmunofluorescencia en células MIO-M1 no permeabilizadas observamos, luego del estímulo con IGF-1, una redistribución de la MMP de membrana tipo 1 (MT1-MMP), de MMP-2 y IGF-1R hacia los procesos celulares así como un importante acúmulo de estas proteínas sobre la membrana celular. Finalmente, y considerando que estos hallazgos denotan un fenotipo celular migratorio nos propusimos evaluar por ensayos de herida (scratch wound), el efecto de IGF-1 sobre la capacidad migratoria de las células MIO-M1. Los resultados mostraron que bajo estimulo, las CM incrementaron la capacidad de migración sobre proteínas de matriz extracelular, como colágeno tipo I y laminina siendo este proceso dependiente de la interacción de IGF-1 con su receptor. Habiendo analizado los efectos de IGF-1 sobre la regulación de MMPs en células de Müller, a continuación nos planteamos analizar los efectos de la hipoxia sobre estas proteinasas a modo de reproducir in vitro lo que ocurriría en patologías como las retinopatías. Nuestros estudios, en CM, demostraron que bajo condiciones de hipoxia, si bien la relación de MMP-2/pro-MMP-2 aumentó respecto a normoxia, el efecto de IGF-1 sobre la regulación de MMP-2 fue similar al demostrado en condiciones de normoxia. Además por ensayos de Western blot también observamos que la hipoxia no modifico la expresión proteica de MT1-MMP inducida por IGF-1 en estas células.

    Finalmente, la relevancia fisiopatológica de los estudios en el modelo in vitro fue evaluada utilizando un modelo de neovascularización inducida por oxigeno (OIR) en ratones, el cual ha sido ampliamente estandarizado y reproducido en nuestro laboratorio a juzgar por la presencia de áreas avasculares así como de ovillos neovasculares hacia la cavidad vítrea. En este modelo se analizó por ensayos de inmunofluorescencia la expresión de IGF-1R observándose en células GFAP positivas, lo cual confirmó que durante el desarrollo IGF-1R se expresa a nivel de astrocitos y bajo condiciones de hipoxia en CM, entre otras. Conociendo que in vitro IGF-1 regula la actividad de MMP-2 en CM, posteriormente evaluamos la expresión de MMP-2 en el tejido retinal. Así, observamos que células positivas para glutamina sintasa (GS) un marcador especifico de CM, fueron positivas para MMP-2 lo cual confirma la expresión de MMP-2, en el modelo in vivo, por las CM. En el modelo de OIR, MMP-2 se expresó preferencialmente en los endfeet de las CM coincidiendo con el área de ovillos NV. Finalmente y con el propósito de analizar la contribución de IGF-1 en los procesos de NV, se administró a P12, por via intraocular, un anticuerpo que bloquea específicamente la activación de 3 IGF-1R, αIR3, en el modelo de OIR. En forma notable, el bloqueo del receptor de IGF-1 logró inhibir la NV así como disminuir el área avascular generando un efecto normalizador en la vasculatura de retinas de animales OIR.

    En conjunto, estos resultados demuestran que el Sistema IGF-1/IGF-1R regula la actividad de MMP-2 en CM, colaborando con la neovascularización de la retina durante procesos isquémicos proliferativos como las retinopatías. Además, el sistema IGF-1/IGF-1R al actuar como un factor estimulante de la migración de la propia célula de Müller, tendría implicancias tanto durante el desarrollo retinal como en procesos neurodegenerativos. Respecto al primero, actuando como regulador de la migración celular hacia las distintas capas retinales mientras que en el segundo estaría asociado con la aplicación de terapias celulares. Finalmente, el bloqueo terapéutico de IGF-1R en el modelo de OIR, el cual demuestra poseer un gran potencial de normalización de la vasculatura, se convierte en una posible alternativa terapéutica para el tratamiento de las retinopatías proliferativas retinales como la ROP y la RDP.

  • English

    Insulin-like growth factor I (IGF-I) exerts multiple effects on different retinal cell types in both physiological and pathological conditions. Different diseases such as retinopathy of prematurity (ROP) and proliferative diabetic retinopathy (PDR) which involve neovascularization (NV), in late stages can cause partial or total reduction of vision. It is known that in NV, hypoxia is the main trigger which activates VEGF and regulates the expression of integrins and extracellular proteinases, mediators for endothelial cell migration and proliferation. However, the role of other factors such as IGF-1, which acts in a hypoxia-nondependent fashion, has not been fully elucidated.

    Although the endothelial cells are considered the main cell in the NV process, the Müller glial cell (MC) that plays a critical role in maintaining the homeostasis of the extracellular space and in the preservation of the integrity of the blood-retinal barrier, deserve special attention in the NV.

    Their associations with retinal vessels as well as their ability to synthesize growth factors such as VEGF and metalloproteinase (MMPs) highlight the relationship between this cell type and the development of retinal NV. Preliminary evidences from our group indicate that IGF-1R is highly expressed in MC and that under stimulation with IGF-1 is able to regulate the MMPs activity.

    Therefore, the main interest of this work was to investigate the IGF-1 effect on the extracellular proteolytic activity in different experimental models.

    Using a human glial cell line, MIO-M1, we demonstrated by Western blot assays that IGF-1 was able to activate its receptor and to promote the activation of the MAPK/ERK and PI3K/AKT signaling pathways. By zymography assays we observed in the MIO-M1 supernatants a relative decrease in the active form of MMP-2, compared with that obtained in non-stimulated cells. This MMP-2 activity regulation in the supernatants was correlated with an increase in MMP-2 at cell lysate. Furthermore, we demonstrated that this process was blocked by the PI3-kinase inhibitor LY294002. In addition, by immunofluorescence microscopy in MIO-M1 cells we observed that MMP-2, MT1-MMP and IGF-1R were mainly localized in the membrane surface towards the cellular processes. Finally, considering that these findings denote a migratory cell phenotype we decided to evaluate by wound assays (scratch wound), the IGF-1 effect on the migratory capacity of MIO-M1 cells. The results demonstrated that IGF-1 induces an increased migratory capacity of MC attached on different extracellular matrix proteins, such as laminin and collagen I.

    Next we demonstrated that in hypoxia, the IGF-1 effect on the MMP-2 regulation was similar to that shown in normoxic conditions. By Western blot assays also observed that hypoxia did not modify the MT1-MMP protein expression induced by IGF-1 in these cells.

    Thus, the pathophysiological relevance of the in vitro studies was evaluated using an oxygen induced retinopathy (OIR) mouse model, which has been widely reproduced in our laboratory. In this model, we first evaluated the IGF-1R expression. By immunofluorescence assay we demonstrated receptor expression in GFAP positive cells, confirming that during development IGF1R is expressed in astrocytes and under hypoxic conditions in MC, among others. Then, we observed that glutamine synthetase (GS) positive cells were also positive for MMP-2, confirming the MMP-2 expression in MC. Finally, in the OIR mouse model we demonstrated that a single intravitreal injection of the IGF-1R blocking antibody (αIR3) at postnatal day (P) 12 significantly reduced retinal NV and enhanced the physiological revascularization of the retinal vascular plexus at P17.

    These results demonstrate, for first time, that the IGF-1/IGF-1R system regulates the MMP-2 activity in MC, contributing to the MEC remodeling during the retinal NV process. Finally our findings also indicate, that the αIR3 antibody might possibly be used to promote intraretinal revascularization and thus prevent the abnormal NV in ischemic vision-threatening retinal diseases.