Respuesta inmune a gangliósidos en un modelo experimental de neuropatía

• Autores: Samanta Funes
• Directores de la Tesis: Gustavo Alejandro Nores (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2016
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    Los gangliósidos, glicanos propios abundantes en tejido neural, han sido propuestos como los principales blancos antigénicos en el Síndrome de Guillain-Barré (SGB). Aunque la etiología de esta enfermedad de tipo autoinmune es desconocida, se cree que la respuesta inmune elaborada hacia un patógeno, podría reaccionar en forma cruzada con gangliósidos de los nervios periféricos. Conejos inmunizados con una mezcla de gangliósidos de cerebro bovino (BBG) y hemocianina de lapa californiana (KLH por su sigla en inglés) como proteína carrier, desarrollan una neuropatía clínicamente similar al SGB. Sin embargo, la enfermedad no se produce si en lugar de utilizar KLH se emplea albúmina de suero bovino metilada (BSAm). Con el objeto de caracterizar el desarrollo de la respuesta inmune humoral en este modelo animal, grupos de conejos fueron inmunizados con distintos inmunógenos. Un grupo fue inmunizado con KLH/BBG y otro con BSAm/BBG. Con el objetivo de evaluar la función carrier de KLH en el modelo experimental, otros dos grupos fueron inmunizados en base a un protocolo alternativo de inmunización (BSAm/BBG+KLH y KLH+BBG), en el que KLH se administra en emulsiones separadas. Además, se utilizaron dos grupos controles inmunizando sólo con BBG o sólo con KLH. Se evaluaron tanto los signos clínicos como la respuesta inmune generada (título, isotipo y especificidad de los anticuerpos anti-gangliósidos). Todos los animales inmunizados con KLH/BBG mostraron signos clínicos de neuropatía y se les detectaron inmunoglobulinas de isotipo G (IgG) que reconocen a gangliósidos de estructura simple (GA1) y compleja (GM1 y GD1b). Estos anticuerpos fueron parcialmente bloqueados por pre-incubación con KLH soluble indicando su reactividad cruzada. El porcentaje de reactividad cruzada con KLH se modificó a lo largo del tiempo (cambio de la especificidad de los anticuerpos). La reducción en el porcentaje de anticuerpos con reactividad cruzada coincide generalmente con el comienzo de los signos clínicos. Ningún animal de los grupos controles (Grupos BBG o KLH) se enfermó, y sólo en aquellos inmunizados con KLH se detectó una leve reactividad de anticuerpos de isotipo IgG que reconocen GA1 y que son totalmente bloqueados por preincubación con KLH soluble. Utilizando la lectina del maní (PNA) se corroboró en KLH la existencia de un determinante presente también en GA1/GM1/GD1b Galβ1-3GalNAc). Si bien el grupo BSAm/BBG no enfermó, al inmunizar por separado también con KLH (BSAm/BBG+KLH) se revirtió esta situación y se generó la neuropatía. Sin embargo, la inmunización con BBG y KLH por separado (KLH+BBG) no produce signos clínicos de enfermedad. Finalmente, entre los animales que desarrollaron la neuropatía, aquellos que enfermaron tempranamente presentaron un mayor porcentaje de anticuerpos anti-GA1 de alta afinidad en suero pre-inmune, comparado con aquellos que enferman de forma tardía. Estos resultados sugieren que, la presencia de KLH en la inmunización es requerida para generar la enfermedad. Los anticuerpos comenzarían reconociendo los azúcares terminales compartidos entre KLH y GA1 para luego expandir la región identificada. Como consecuencia, se produce un cambio de especificidad de los anticuerpos hacia los gangliósidos, acompañado del comienzo de la neuropatía. Si bien los gangliósidos no poseen la capacidad de generar una respuesta de isotipo IgG, podrían re-direccionar la respuesta anti-GA1 inducida por KLH hacia gangliósidos con estructuras más complejas. Tanto la especificidad fina, como la afinidad de los anticuerpos resultaría clave en el comienzo de la neuropatía, incluso un elevado porcentaje de anticuerpos anti-GA1 de alta afinidad en suero pre-inmune se asoció con el comienzo temprano de la misma. Se establecen dos conclusiones principales. En primer lugar, KLH estaría cumpliendo el papel tanto de carrier como de inmuno-estimulador específico. En segundo lugar, el factor de susceptibilidad a desarrollar la neuropatía podría estar relacionado a la afinidad de los NOAbs anti-GA1 presentes en el suero pre-inmune. Según nuestro conocimiento, este trabajo es el primero no sólo en describir en detalle la respuesta inmune generada durante el desarrollo de la neuropatía en un modelo experimental, sino también en establecer un posible factor de susceptibilidad del huésped.

  • English

    Gangliosides are abundant glycans in neural tissue. They have been proposed as one of the major antigenic targets in Guillain-Barré syndrome (SGB). Although the etiology of this autoimmune disease is unknown, it is believed that the immune response elaborated to a pathogen could cross-react with peripheral nerve gangliosides. Rabbits immunized with bovine brain gangliosides (BBG) and keyhole limpet hemocyanin (KLH) like carrier protein develops a neuropathy clinically similar to SGB. However the disease does not occur if methylated bovine serum albumin (BSAm) is used instead KLH.

    In order to characterize the development of humoral immune response in this animal model, groups of animals were immunized with different immunogens. A group was immunized with KLH/BBG and another one with BSAm/BBG. To evaluate the carrier function of KLH in the experimental model also two other groups were immunized with an alternative immunization protocol (BSAm/BBG+KLH and KLH+BBG) in which KLH was administered in a separate emulsion. On the other hand, two control groups immunized only with gangliosides or only with KLH were also used. Clinical signs and the immune response generated (title, and isotype specificity of the anti- gangliosides antibodies) were evaluated in all groups.

    All the animals immunized with KLH/BBG showed clinical signs of neuropathy and IgG antibodies were detected that recognize simple (GA1) and complex (GM1 and GD1b) structure gangliosides. These antibodies were partially blocked by pre-incubation with soluble KLH indicating cross-reactivity.

    The percentage of cross-reactivity with KLH was modified over time (change in antibodies specificity). The reduction in the percentage of cross-reactive antibodies generally coincides with the onset of clinical signs. No animals of the control groups got sick (KLH or BBG groups). Only in rabbits immunized with KLH was detected a slight reactivity of IgG isotype antibodies that recognize GA1, and was completely blocked by preincubation with soluble KLH. Using the peanut agglutinin (PNA) was confirmed in KLH, the existence of a determinant also present in GA1/GM1/GD1b (Galβ1-3GalNAc). While the BSAm/BBG group did not get sick, when we also immunized this group with KLH separately (BSAm/BBG+KLH) the situation is reversed and neuropathy is generated.

    Nevertheless separately immunization with KLH and BBG (KLH+BBG) did not produce clinical signs of disease. Finally among the animals that developed neuropathy, those with an early onset had a higher percentage of high affinity anti-GA1 antibodies at pre-immune serum compared with those with a late onset.

    These results suggest that the presence of KLH in the immunization is required for development the disease. The antibodies begin recognizing the terminal sugars shared between KLH-gangliosides and then expand the identified region. Consequently it occur a change of antibodies specificity to gangliosides, accompanied by the onset of neuropathy. Although gangliosides do not possess the ability to generate an IgG isotype response, it may redirect the anti-GA1 response produced by KLH against gangliosides with more complex structures. Fine specificity and affinity of the anti-gangliosides antibodies are key in the onset of neuropathy, in fact a high percentage of anti-GA1 high affinity pre-immune antibodies was associated with early onset of the disease.

    Two main conclusions are established. First, KLH would have two fundamental roles, carrier and specific immune stimulant. Second, the susceptibility factor to develop the neuropathy may be related to the affinity of anti-GA1 NOAbs present in the pre-immune serum. To our knowledge, this work is the first not only to describe in detail the immune response generated during the development of neuropathy in an experimental model but also to establish a possible host susceptibility factor.