El sistema de señales iniciado por Sonic Hedgehog participa en la migración orientada de las células de la cresta neural y es alterado por la exposición a etanol

• Autores: Ezequiel Julián Tolosa
• Directores de la Tesis: Roberto A. Rovasio (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2019
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    Las células de la cresta neural (CCN) forman una población transitoria de células embrionarias que migran con precisión, colonizan distintas regiones y se diferencian en múltiples derivados. Sus características definen un modelo biológico excelente para estudiar los mecanismos de regulación morfogenética, por ejemplo los que modulan la orientación celular hacia diferentes destinos, tanto en condiciones normales como en diversas patologías embrionarias y tumorales. Apoyados en antecedentes de nuestro y de otros laboratorios, nos propusimos hallar evidencias sobre la migración orientada de CCN hacia la región ocular como respuesta a gradientes de concentración del morfógeno Sonic hedgehog (Shh), y determinar si este potencial mecanismo-guía es alterado por exposición a etanol.La vesícula óptica es una de las regiones “blanco” de las CCN cefálicas, donde formarán ―entre otros derivados― el importante ganglio parasimpático ciliar. Sobre cultivos de CCN de embrión de pollo, mediante videomicroscopía y evaluación cuantitativa basada en criterios direccionales estrictos, demostramos la respuesta quimiotáctica hacia gradientes extracelulares de Shh. Este mecanismo direccional fue reproducido en co-cultivos con explantos de notocorda (fuente de Shh) o con su medio condicionado, y fue bloqueado en presencia de anticuerpo anti-Shh (anti-función), o de ciclopamina (bloqueante de Smo, proteína activadora de la señal de Shh), o con un morfolino anti-Smo. Posteriormente, demostramos que el receptor Ptch (del ligando Shh), y la proteína Smo (transductora de la señal Shh/Ptch), se expresan en CCN in vitro. Sobre embriones enteros, mediante hibridación in situ e imnunocitoquímica también mostramos la expresión del ARNm y de la proteína Shh en la región ocular, así como la expresión de Ptch, Smo y varios integrantes del sistema Gli/Sufu en la región de las CCN cefálicas. Sobre la base de estos datos, procedimos a bloquear el sistema Shh>Ptch/Smo en el embrión entero, evaluando la migración/distribución de CCN cefálicas. Embriones en etapa temprana de neurulación fueron transfectados con morfolino anti-Smo con Endo-Porter o electroporación, con plásmidos de Ptch mutado seguido de electroporación, y sus correspondientes controles. Con un esperable grado de diversidad en la distribución de CCN, se pueden resumir los resultados concluyendo que en el lado electroporado (actuando de control el lado opuesto), tanto el bloqueo de Smo, como la expresión del receptor Ptch mutado (dominante negativo), se asocian a una menor densidad de CCN mesencefálicas invadiendo la región ocular, y con frecuencia se vinculan con mayor densidad celular en la región mesencefálica lateral del mismo lado. Estos resultados fueron confirmados por evidencias obtenidas del implante de microesferas embebidas con Shh o ciclopamina en la misma etapa del desarrollo, apoyando fuertemente la idea que el morfógeno participa en la orientación de las CCN.

    Considerando que las CCN cefálicas están claramente involucradas en la etiopatogenia del Sindrome Fetal Alcohólico, los resultados obtenidos en este contexto experimental mostraron que la quimiotaxis de CCN orientada por Shh fue alterada por exposición a etanol in vitro. Por su parte, embriones expuestos a etanol en etapas tempranas mostraron perturbaciones del desarrollo cráneo-facial imputable a una deficiente distribución de CCN cefálicas, también asociado con una anormal expresión in situ del morfógeno Shh. Como conclusión se puede indicar que las CCN cefálicas migran orientadas por quimiotaxis en respuesta a gradientes de concentración de Shh en su micro-ambiente. Las moléculas que permiten esta respuesta (Shh, Ptch, Smo) fueron demostradas in vitro e in vivo en el embrión entero, tanto por su localización in situ como por su actividad funcional en la etapa de migración de CCN cefálicas hacia la región de la vesícula óptica. Estos hallazgos permiten proponer la participa ción del morfógeno Shh en el mecanismo que guía a las CCN hacia su destino, apoyando la idea de que la deficiente orientación de la sub-población ciliar de CCN hacia la vesícula óptica sería la base del aumento de células que invaden/colonizan otras regiones del área cefálica. Estos resultados en conjunto contribuyen a comprender mejor un mecanismo fundamental para la distribución precisa de células embrionarias.Asimismo, aportan nuevos enfoques para profundizar el estudio de perturbaciones inducidas por un agente teratógeno de uso común poco controlado. Finalmente, demuestran una nueva actividad de orientación o guía celular para el morfógeno Shh (probablemente por una vía no-canónica), además de sus otras conocidas funciones.

  • English

    The neural crest cells (NCC) are a transient embryonic cell population, which migrates through the embryo body, colonizes specific regions and gives rise to several different cell types. These features define these cells as an excellent biological model for studying morphogenetic regulation mechanisms, such as those controlling the cellular targeting to different destinations, either in normal conditions or in embryonic and tumoral pathologies.

    Based on ours and others previous work on NCC migration, here, we propose to define the mechanism of NCC-oriented migration toward the optic vesicle, a target region of cephalic NCC, in response to concentration gradients of Sonic hedgehog (Shh), and establish whether this potential guiding mechanism is altered by exposure to ethanol.

    We initially demonstrated that the components of the Shh receptor complex, Ptch and Smo, are expressed in NCC in vitro. Similarly, on whole embryos, using in situ hybridization and immunocytochemistry, we show the expression of mRNA and protein Shh in the embryonic ocular region as well as the expression of Ptch, Smo and several members of the Gli/Sufu system in the region of cephalic NCC.

    Furthermore, using chick embryo NCC cultures, video microscopy and quantitative analysis based on strict directional criteria, we demonstrate the chemotactic response of NCC to Shh extracellular gradients. This directional cell behavior was also observed in co-cultures with explants of notochord (Shh source) or its conditioned medium; and was inhibited by anti-Shh blocking function antibody, or small molecule inhibitor, cyclopamine, or anti-Smo morpholino.

    Similarly blockade of the Shh>Ptch/Smo signal system in the whole embryo impairs the migration/distribution of cephalic NCC. Embryos at early neurulation stage were microinyected with anti-Smo morpholino or Ptch mutated plasmid (Ptch1∆loop2) show a lower density of mesencephalic NCC invading the region of the optic vesicle, and often a higher cell density in the mesencephalic lateral region of the same side. According to these results, experiments with implantation of microspheres embedded with Cyclopamine or Shh at the same embryonic stage, provided additional evidence to support and extend the main find that the Shh morphogen is involved, as a guide molecule, in the orientation mechanism of NCC.

    Considering that cephalic NCC are clearly involved in the etiopathogenic cues of the Fetal Alcohol Syndrome, we evaluate the effect of the teratogen ethanol on chemotaxis of NCC induced by Shh gradients. Ethanol exposure altered migration in vitro and in vivo. Experiments with embryos exposed to ethanol at early stages, in a model reproducing that developmental pathology, showed disruption of the cephalic NCC distribution during the craniofacial development associated with abnormal in situ expression of the Shh morphogen.

    These results lead to the conclusion that cephalic NCC migrate guided by a chemotactic mechanism in response to Shh concentration gradients. Further analysis of the mechanism reveals that this phenomenon is regulated in a Smo-dependent manner. Smo expression localize at the stage of cephalic NCC migration toward the optic vesicle. Inactivation of the receptor’s function using genetic and pharmacological tools impairs Shh-dependent migration. These findings extend the idea that perturbed orientation of a sub-population of NCC toward the optic vesicle could be the basis of the increase of cell density at the mesencephalic level of the same side, invading/colonizing other embryonic cephalic regions.

    As a whole, results of this work improve the understanding of a fundamental mechanism for the accurate distribution of embryonic cells, and their perturbation induced by a commonly consumed teratogen; also providing a new biological activity of cellular guidance for the Shh morphogen, in addition to its other known developmental functions.