Modificaciones inducidas por Ghrelina exógena sobre la actividad funcional de las gametas, la fertilización y el desarrollo embrionario temprano en un modelo murino

• Autores: Eugenia Mercedes Luque
• Directores de la Tesis: Ana Carolina Martini (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2015
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    Ghrelina (Ghr) es un polipéptido que vincula el balance energético con la reproducción.Si bien la hiperghrelinemia secundaria a restricción alimentaria reduce el éxito reproductivo, los nive les de Ghr aumentan fisiológicamente durante la gestación, por lo que se ha sugerido que esta proteína cumple un papel importante en este proceso. Los objetivos del presente Trabajo de Tesis fueron: 1) explorar mediante experimentos in vitro, los efectos de Ghr (10-9 y 10-7M) y/o su antagonista ((D-Lys3) GHRP-6, 10-5 y 10-4M) sobre la motilidad, vitalidad y reacción acrosomal espontánea o inducida por progesterona (P4) a los 3, 40 y 120 min de incubación, así como sobre la fertilización in vitro; 2) determinar el papel de Ghr en la fertilización in vivo, inyectando hembras de ratón con Ghr (2 ó 4 nmol/animal/día) y/o el antagonista (6 nmol/animal/día) durante una semana previa a la cópula y hasta la misma, evaluando a los 18 días de gestación el éxito reproductivo; 3) establecer el papel de Ghr en el desarrollo embrionario temprano y la implantación, inyectando a las hembras preñadas con Ghr y/o el antagonis ta, a) desde la inducción de ovulación hasta las 80 h de la misma, evaluando el porcentaje de fertilización y el desarrollo embrionario pre-implantatorio o, b) desde el 3º al 7º día de preñez, sacrificando las hembras a los 18 días poscópula y cuantificando el éxito reproductivo. En base a los resultados se agregó un cuarto objetivo: 4) evaluar, en hembras inyecta das con la mayor dosis de Ghr y/o el antagonista desde el día 3 al 7 de gestación, la anátomo-patología uterina, la marcación inmunohistoquímica de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) e inducible (iNOS) y la concentración plasmática de P4. Refe rente al objetivo 1, observamos que Ghr disminuyó la motilidad espermática y aumentó la reacción acrosomal a los 3 min de incubación (motilidad: control=54,1±4,3 vs Ghr 10-M=42,7±6,0 y Ghr 10-7M=40,7±5,9. Reacción acrosomal: control=9,6±1,2 vs Ghr 10-9M=13,2±1,2; n=8/grupo, p<0,05). Este efecto no se detectó a los 40 ni a los 120 min. Los tratamientos no modifica ron los índices de fertilización in vitro,ni los de partenogénesis. En cuanto al objetivo 2, Ghr 4 nmol aumentó el porcentaje de hembras con pérdida embrionaria (Ghr 4 nmol=73 vs control= 11, n=11 y 9/grupo respectivamente, p<0,05) y el antagonista aumentó el porcentaje de hembras con atrofia fetal y el porcentaje de fetos atrofiados/hembra. En el objetivo 3a, el antagonista disminuyó la tasa de fertilización y todos los tratamientos retrasaron el desarrollo embrionario (porcentaje de blastocitos: control=78 vs Ghr 4 nmol=51, Ghr 2 nmol=62, hr+antagonista = 48 y antagonista=61, n=79-102 embriones/tratamiento, p<0 ,05). Cuando los tratamientos fueron aplicados durante el período peri-implantatorio (objetivo 3b), tanto Ghr como el antagonista disminuyeron el peso fetal y la ganancia de peso de las hembras gestantes (p<0,05). Asimismo, Ghr 4 nmol, Ghr+antagonista y antagonista aumentaron el porcentaje de hembras con pérdida embrionaria o atrofia fetal. En el cuarto objetivo, se detectó un aumento significativo de las resorciones embrionarias y del porcentaje de atrofia fetal en las hembras tratadas con el antagonista; aparentemente los efectos de Ghr ocurrirían en forma más tardía. Ghrelina y el antagonista aumentaron la expresión de eNOS e iNOS uterina. Como hallazgos preliminares observamos que los tratamientos con Ghr o el antagonista aumentaron la marcación de células “na tural killer” uterinas, macrófagos y linfocitos. En resumen, es aparente que existe un nivel intragestacional “ideal” de Ghr, por encima o debajo del cual se registran alteraciones en la gestación temprana. Algunas evidencias preliminares apuntan al óxido nítrico (NO) y a la respuesta inmunológica materna como posibles causas de estas alteraciones

  • English

    The polypeptide ghrelin (Ghr) links energy balance and reproduction.

    Hyperghrelinemia secondary to food restriction exerts negative effects on reproductive functions. Nevertheless, Ghr concentrations present a physiological increase during gestation, suggesting that Ghr could excert an important role on pregnancy.

    The objectives of this study were: 1) using an in vitro approach, to explore the effects of Ghr (10-9 y 10-7M) and/or its antagonist ((D-Lys3)GHRP-6, 10-5 y 10-4M) on sperm motility, viability, acrosome reaction (after 3, 40 and 120 min of incubation), and fertilization index; 2) to determine the in vivo role of Ghr on fertilization, by injecting female mice with Ghr (2 ó 4 nmol/animal/day) and/or its antagonist (6 nmol/animal/day) from one week previous to mating confirmation and evaluating the reproductive success at gestation day 18; 3) to evaluate the role of Ghr on embryo development and implantation, by injecting females with Ghr or its antagonist, a) from ovulation induction to 80 h after ovulation and evaluating fertilization index and embryo development or, b) from day 3 to 7 of gestation, by euthanasia of the females at pregnancy day 18 and quantifying reproductive success. Based on the results, we further investigated: 4) in females injected with the higher dose of Ghr and/or its antagonist from day 3 to 7 of gestation, the uterine anatomo-pathology, the expression of endothelial (eNOS) or inducible (iNOS) nitric oxide synthase (by immunohistochemistry) and plasma progesterone concentrations.

    In experiment 1, Ghr significantly diminished sperm motility and increased acrosome reaction after 3 min of incubation (motility: control=54.1±4.3 vs Ghr 10- 9M=42.7±6.0 y Ghr 10-7M=40.7±5.9. Acrosome reaction: control=9.6±1.2 vs Ghr 10- 9M=13.2±1.2; n=8/group, p<0.05). After 40 or 120 min of incubation, no effects were detected. In vitro fertilization or parthenogenic indexes were not modified either.

    In experiment 2, Ghr 4 nmol increased the percentage of females presenting embryo loss (Ghr 4 nmol=73 vs control=11, n=11 y 9/group respectively, p<0.05) and the antagonist increased the percentages of females with fetal atrophy and the percentage of fetuses atrophied/female.

    In experiment 3, the antagonist significantly reduced the fertilization index and all treatments delayed embryo development (porcentaje of blastocytes: control=78 vs Ghr 4 nmol=51, Ghr 2 nmol=62, Ghr+antagonist=48 and antagonist=61, n=79-102 embryo/treatment, p<0.05). When the treatments were applied during the peri-implantation period (objective 3b), not only Ghr but also the antagonist decreased fetal weight and females gained weight thorough pregnancy (p<0.05). Moreover, Ghr 4 nmol, Ghr+antagonist and the antagonist increased the percentage of females with embryo loss or fetal atrophy.

    In experiment 4 we detected in females treated with the antagonist, a significant increase in embryo resorption and in the percentage of fetal atrophy; apparently Ghr effects appeared later during gestation. Ghrelin and the antagonist enhanced uterine eNOS and iNOS expression. As preliminary results, we detected that Ghr or the antagonist increase uterine natural killer cells, lymphocytes and macrophages.

    In summary, apparently there is an “ideal” intragestational Ghr level; when this concentration increases or decreases, gestational alterations seem to emerge. Some preliminary evidences point out to nitric oxide or maternal immunological response as the possible causes.