Evolución de la resistencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa en infecciones respiratorias crónicas y su relación con la hipermutabilidad

• Autores: Claudia Antonella Colque
• Directores de la Tesis: Andrea María Smania (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2020
• Idioma: español
• Número de páginas: 149
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    Pseudomonas aeruginosa es capaz de explotar mecanismos de resistencia intrínsecos y adquiridos para resistir a casi todos los antibióticos actualmente utilizados. Se ha propuesto que la resistencia mediada por mutaciones puede verse estimulada por la presencia de cepas hipermutadoras, las cuales presentan tasas de mutación incrementadas debido a deficiencias en los sistemas de reparación de ADN. En bacterias, la mutagénesis representa uno de los mecanismos principales involucrados en la generación de variabilidad genética, por lo que el control y ajuste de la tasa de mutación resultan fundamentales para la optimización de procesos adaptativos. Las infecciones respiratorias crónicas producidas por P. aeruginosa en pacientes con fibrosis quística (FQ) constituyen un excelente modelo natural para estudiar evolución bacteriana, en el que las células hipermutadoras prevalecen a una frecuencia significativamente mayor a las encontradas en otro tipo de infecciones o en el ambiente, incrementando los desafíos terapéuticos para combatirlas. Durante el transcurso de vida de un paciente con FQ, se administra una amplia batería de antibióticos tendientes a combatir las infecciones bacterianas, sin embargo, como contrapartida, los mismos ejercen una presión de selección que promueve la generación de resistencia y la consecuente adaptación y persistencia de la bacteria. Existe un gran interés y se han logrado grandes avances para entender los mecanismos mutacionales que generan resistencia en P. aeruginosa. Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado la implicancia de la diversidad genética poblacional en la resistencia bacteriana ni tampoco su evolución in vivo a largo plazo en un mismo paciente, en el que sea posible considerar el efecto de altas tasas de mutación bacteriana y el tratamiento antibiótico recibido. El presente trabajo de tesis tuvo como primer objetivo estudiar la evolución del resistoma mutacional de un linaje hipermutador de P. aeruginosa combinando un análisis longitudinal y transversal de aislados clínicos colectados de un paciente FQ, a lo largo de 20 años de infección crónica. Como segundo objetivo, el trabajo estuvo abocado a investigar la evolución de la enzima β-lactamasa AmpC, considerada el principal mecanismo de resistencia a antibióticos β-lactámicos en P. aeruginosa. Este último objetivo se abordó a través de una caracterización a nivel fenotípico, molecular y estructural de AmpC en poblaciones bacterianas del mismo linaje hipermutador de P. aeruginosa abarcando ahora un período de 26 años de infección crónica. Finalmente se indagó en la diversidad genética de ampC en poblaciones de P. aeruginosa obtenidas a partir de una cohorte de 24 pacientes adultos FQ lo que permitió asimismo investigar la asociación entre la mutagénesis en este gen y el fenotipo hipermutador en el contexto de las infecciones pulmonares crónicas. Los resultados obtenidos demuestran que en la historia evolutiva del linaje hipermutador bajo estudio, signada por una selección negativa y acumulación de miles de mutaciones a nivel del genoma global, particularmente aquellas mutaciones acumuladas en los genes de resistencia fueron seleccionadas positivamente en directa correlación con la fuerte presión ejercida por el tratamiento con antibióticos. Durante el progreso de la infección, el linaje bacteriano mostró un incremento progresivo de la resistencia antibiótica, configurándose poblaciones genotípicamente diversas en las que sublinajes coexistentes convergieron a un perfil de multiresistencia (MDR). Dichos sublinajes emergieron por evolución paralela a través de diferentes vías evolutivas que afectaron genes de las mismas categorías funcionales. De manera interesante, ampC y ftsI, que codifican para la β-lactamasa AmpC y la proteína de unión a penicilina PBP-3, respectivamente, estuvieron dentro de los genes más frecuentemente mutados. De hecho, ambos genes fueron objeto de múltiples eventos mutacionales, los cuales dieron lugar a la coexistencia de alelos altamente diversos que podrían constituir la base de los niveles de resistencia a β-lactámicos en los aislados clínicos del paciente. Esta observación motivó el estudio de la evolución de AmpC, lográndose evidenciar que las variantes ampC evolucionadas confieren elevados niveles de resistencia a una batería de antibióticos β-lactámicos incluyendo la cefalosporina de 5ta generación ceftolozano, a la cual la población bacteriana nunca estuvo expuesta. Asimismo, los estudios de cinética-enzimática demostraron que las distintas variantes AmpC poseen una eficiencia catalítica mejorada, fundamentalmente hacia cefalosporinas incluyendo ceftolozano. Por su parte, los estudios de simulación por dinámica molecular arrojaron resultados sobre modificaciones estructurales claves en la enzima que permitirían una ampliación de la entrada al bolsillo de unión a sustrato, favoreciendo el correcto acomodamiento de cefalosporinas y monobactámicos con cadenas laterales R1 más voluminosas. Los estudios en poblaciones de aislados de P. aeruginosa obtenidos de diferentes pacientes con FQ confirmaron el rol fundamental de las mutaciones específicas en ampC analizadas en este trabajo, determinado por su alta frecuencia de emergencia y selección. Por último, los resultados permitieron determinar una correlación significativa entre el número de mutaciones en ampC y el fenotipo hipermutador, aportando evidencias que permiten por primera vez asociar la hipermutabilidad con mutaciones adaptativas in vivo. En conclusión, los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis demuestran cómo la dinámica del tratamiento antibiótico que recibe un paciente con FQ constituye una fuerza selectiva que conduce a la adaptación de P. aeruginosa hacia un perfil MDR. En un contexto de altas presiones selectivas, las cepas hipermutadoras, además de impulsar la evolución de la resistencia antibiótica a través de la mutación simultánea de varios genes, favorece la emergencia de alelos adaptativos novedosos agrupando mutaciones beneficiosas y/o compensatorias en un mismo gen, que en el caso particular del tratamiento con β-lactámicos implica mutaciones repetidas en el gen ampC, expandiendo así las estrategias de persistencia de P. aeruginosa

  • English

    Pseudomonas aeruginosa has the incredible capacity to exploit both intrinsic and acquired resistance mechanisms to become resistant to practically all available antibiotics. It has been proposed that mutation-mediated resistance could be stimulated by the presence of hypermutator strains whose increment in the mutation rate is based on disruption of DNA repair systems. In bacteria, mutagenesis represents one of the main mechanisms involved in the generation of genetic variability. In this sense, the control of mutation rates remains fundamental for the optimization of adaptive processes. Chronic respiratory infections caused by P. aeruginosa in cystic fibrosis (CF) patients constitute an excellent natural model to study bacterial evolution, in which hypermutator strains are present in higher frequency than those in other type of infections or in the environment, increasing therapeutic challenges in order to combat them. During the course of a CF patient lifetime a whole variety of antibiotics are administrated to combat bacterial infections, however they can also act as selective forces able to promote resistance and consequently bacterial adaptation and persistence.

    Understanding mutation-mediated resistance mechanisms in P. aeruginosa is currently of a great interest and much progress has been made. Nevertheless, neither the study of genetic population diversity and its implication in bacterial resistance nor the analysis of the consequences of high mutation rates and antibiotic treatment in long term in vivo evolution in a single patient has been investigated.

    The first objective of this thesis is to study the evolution of the mutational resistome from a hypermutable lineage of P. aeruginosa by combining longitudinal and transversal analysis of isolates collected from a single CF patient throughout 20 years of chronic infection. As a second objective, the work focused on the evolution of the β-lactamase AmpC, considered the main mechanism of resistance to β-lactam antibiotics in P. aeruginosa. This goal was achieved throughout a phenotypic, structural and molecular characterization of AmpC in bacterial populations obtained from the same hypermutator lineage encompassing 26 years of chronic infection. Finally, ampC genetic diversity was investigated in P.

    aeruginosa populations obtained from a cohort of 24 adult CF patients, which also allowed for the investigation of the association between gene mutagenesis and the hypermutator phenotype in the context of pulmonary chronic infections. Results show that the evolutionary history of the hypermutator lineage of P.

    aeruginosa was signed by purifying selection and the accumulation of thousands of mutations at a global genomic level. Particularly, mutations accumulated in resistance genes were positively selected in high correlation with the selective forces imposed by antibiotic treatment. Along the infection progress, bacterial lineage showed a progressive increment in antibiotic resistance, where genotypically diverse populations clustered and their sublineages converged in a multidrug resistance (MDR) phenotype. Those sublineages emerged through parallel evolution of distinct evolutionary pathways that affected genes of the same functional categories. Interestingly, ampC and ftsI, which code for the β-lactamase AmpC and penicillin binding protein 3 (PBP-3) respectively, where among the most frequently mutated genes. In fact, both genes were targeted by multiple mutational events that gave rise to the coexistence of highly diverse alleles, which could constitute the basis of the high β-lactam resistance observed in clinical isolates from the patient. This observation motivated the study of AmpC evolution, providing evidence that evolved ampC variants confer high levels of resistance to a variety of β-lactams including the 5 th generation cephalosporin ceftolozane, to which the bacterial population has never been exposed. Likewise, enzyme-kinetic studies revealed that AmpC variants possess improved catalytic efficiencies primarily to cephalosporins including ceftolozane. On the other hand, molecular dynamic simulation studies yielded results on key enzyme structural modification, revealing that a widening of the substrate binding pocket favors the accommodation of cephalosporins and monobactams with larger R1 side chains.

    P. aeruginosa population studies obtained from different CF patients confirmed the fundamental role of the specific combination of mutations in ampC, determined by their high frequency and selection. Finally, results indicated a significant correlation between the number of ampC mutations and hypermutator phenotype, providing evidence that for the first time allow an association between hypermutability and specific adaptive mutations in vivo.

    In summary, the results obtained in this thesis show how the dynamic antibiotic treatment received by a CF patient constitutes a selective force that drives P. aeruginosa adaptation towards a MDR profile. In this context, hypermutator strains, apart from boosting antibiotic resistance evolution by simultaneously targeting several genes, favor the emergence of adaptive innovative alleles by clustering beneficial/compensatory mutations in the same gene, which in the case of β-lactam treatment implies repeated mutations in the ampC gene, hence expanding P. aeruginosa strategies for persistence.