Oxidación enzimática y organometálica de glicerol para la obtención de compuestos bioactivos

• Autores: Adrián Parodi
• Directores de la Tesis: Ivana Magario (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2022
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Oxidação enzimática e organometálica do glicerol para obtenção de compostos bioativos
  • Enzymatic and organometallic oxidation of glycerol to obtain bioactive compounds
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    Con la motivación de valorizar biomasa bajo los principios de la química verde, en este trabajo de tesis doctoral se evaluaron catalizadores organometálicos y enzimáticos en la oxidación primaria de glicerol para la producción de las triosas gliceraldehído (GA) y dihidroxiacetona (DHA).

    Estándares de ambas triosas fueron evaluados en ensayos de actividad antibacteriana sobre las cepas Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Staphilococcus aureus (ATCC 25922). Se encontró que GA fue activa sobre las tres cepas en dosis del orden de aquellas de monoterpenos naturales (6,25 g/L). Este hallazgo amplía las potenciales aplicaciones de esta sustancia. Por su parte, DHA no demostró bioactividad bajo las condiciones ensayadas. Por lo tanto, los experimentos de oxidación se direccionaron hacia la obtención selectiva de GA.

    Seguidamente, se estableció una técnica analítica alternativa para la detección y cuantificación de glicerol, GA y DHA en muestras acuosas, por medio de cromatografía gaseosa acoplada a un detector de ionización de llama (GC-FID), la cual implica la derivatización con un agente silanizante en un solo paso. La presencia de los analitos sililados fue confirmada por medio de GC-MS y las curvas de calibración validadas y contrastadas con una técnica de análisis por HPLC difundida en la literatura. Se identificó cromatográficamente que cada triosa co-existe en solución como monómero, dímero o hidrato complejizando su análisis. Asimismo, se optimizó el pretratamiento de las muestras de manera de eliminar agua y asegurar la completa derivatización de los analitos.

    Hematin, una protoporfirina de hierro natural fue evaluada en reacciones de oxidación tanto en medio homogéneo, como inmovilizado covalentemente sobre partículas de polimetacrilato. Se utilizó H2O2 como agente oxidante. Se exploraron distintas condiciones de reacción, variando el pH del medio, la concentración de glicerol, de hematin y de H2O2. No obstante, las conversiones logradas fueron bajas. Se discute a la vez, la capacidad del glicerol de actuar como sustrato reductor en la vía peroxidática de hematin. Se presenta evidencia que indica que el intermediario activado de ésta coordina preferentemente a una segunda molécula de H2O2 por sobre la molécula de glicerol. De esta manera, se genera oxígeno molecular y radicales superóxido que desencadenan el blanqueamiento irreversible de hematin. Se hipotetiza además que la acción de hematin sobre glicerol es debida a un proceso tipo Fenton generado por la liberación, en solución, del hierro de su estructura durante el blanqueamiento.

    Por otro lado, MnL -un complejo sintético de manganeso con ligandos polidentados tipo bases de Schiff- no presentó propiedades catalíticas en la producción de GA a partir de soluciones acuosas de glicerol tratadas con H2O2. No obstante, presentó actividad catalítica en la oxidación de fenol (vía peroxidática) y en la descomposición de H2O2 para formar O2 (vía catalática) aunque sólo al inicio de la reacción y deteniéndose rápidamente. Dado que el rol del solvente es crucial para la formación de intermediarios catalíticos relevantes, se chequearon diferentes solventes, con la finalidad de incrementar su eficiencia catalítica. El agregado de solventes con capacidad dadora de electrones como dimetilsulfóxido o acetona al sistema mejoraron la actividad peroxidática de MnL. Se propone un mecanismo de reacciones competitivas de peroxidación y dimerización (inactivación) del complejo MnL.

    Las enzimas oxidasas no requieren del uso de cofactores y son capaces de oxidar alcoholes a aldehídos utilizando oxígeno, pero son inhibidas por el H2O2 generado como subproducto. Se realizaron estudios para determinar la performance en la oxidación primaria de glicerol de dos sistemas bicatalíticos basados en las enzimas comerciales galactosa oxidasa de Dactylium dendroides (GAO) y alcohol oxidasa de Pichia pastoris (AOX), ambas en tándem con hematin, en reemplazo a la enzima catalasa, comúnmente empleada para eliminar H2O2 del sistema. Se hipotetiza que hematin es capaz de cumplir la doble función de convertir el H2O2 ya sea en oxígeno, o generando un colorante en presencia de fenol y 4-aminoantipirina, lo cual es utilizado como método rápido de detección de actividad inicial de oxidasas. Esta hipótesis fue comprobada: se evaluó el efecto de la variación de la concentración de glicerol, enzima y hematin sobre las velocidades de formación de la tinta y se encontró que las tres especies ejercen un aumento de la velocidad de reacción mientras mayor es su concentración. Se pudo estimar así la actividad específica en la oxidación de glicerol, la cual se contrastó con aquella correspondiente a los sustratos naturales de ambas enzimas. Por otro lado, se inmovilizó la enzima GAO por uniones covalentes a un soporte de polimetacrilato y se evaluaron diferentes metodologías para determinar la cantidad de proteína unida. El catalizador inmovilizado resultó activo en el sistema de reacciones acopladas propuesto, lo que constituye un resultado alentador ya que posibilitaría su reutilización y fácil separación de los productos entre lotes de reacción. La evidencia presentada es contundente. Sin embargo, se basó en observaciones indirectas obtenidas durante los primeros minutos de reacción.

    Por estos motivos, se realizaron reacciones de oxidación por tiempos prolongados con los sistemas bicatalíticos oxidasa/hematin, pero sin fenol (como sustrato reductor) ni 4-aminoantipirina. Se hipotetiza que hematin ejerce acción catalática en estas condiciones, consumiendo el H2O2 y generando O2. La evolución de la concentración de oxígeno durante la reacción aportó información útil para comprender ambos sistemas y se comprobó que la presencia de hematin aceleró su consumo en todos los casos. El pico de monómero de GA pudo ser detectado en medios de reacción en los sistemas con GAO, aunque las conversiones de glicerol fueron bajas. La mayor concentración de GA (94.4 mM en 24 h) se obtuvo con el sistema GAO/Hematin a pH 9, partiendo de una concentración de glicerol inicial de 1700 mM. Este resultado fue además superador en relación al obtenido con el empleo de catalasa como co-catalizador. En sistemas con AOX se calcularon grados de conversión de glicerol de entre 7.4 y 19.5 %, partiendo de una concentración inicial de glicerol de 33 mM, aunque solo fue posible estimar una concentración de GA de 3.31 mM luego de 24 h. Se discutieron dos vías por medio de las cuales hematin ejerce su efecto: sobre GAO parece ejercer una acción fundamentalmente peroxidática, reactivando a GAO desde un estado inactivo. Por otro lado, en presencia de AOX, hematin actúa a través de la vía pseudo-catalática que implica la generación de radicales libres que ocasionan su blanqueamiento. De esta manera, AOX queda sin la protección necesaria, inactivándose rápidamente a causa del H2O2 generado, lo cual detiene la reacción.

  • English

    Motivated by the valorization of biomass under the principles of green chemistry, in this doctoral thesis organometallic and enzymatic catalysts were evaluated in the primary oxidation of glycerol in order to produce the trioses glyceraldehyde (GA) and dihydroxyacetone (DHA).

    Standards of both trioses were evaluated in antibacterial activity assays against the strains Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) and Staphilococcus aureus (ATCC 25922). It was found that GA was active against all these strains in doses of the order of those of natural monoterpenes (6.25 g/L). This finding increases the number of potential uses of this substance. On the other hand, DHA did not show bioactivity under the conditions assayed. Hence, the oxidation trials were directed in obtaining GA selectively.

    Next, it was stablished an alternative analytic technique for the detection and quantification of glycerol, GA an DHA in aqueous samples, by means of gas chromatography coupled to a flame ionization detector (GC-FID), which implies the one-step derivatization with a sylilating agent. The presence of the silanized analytes was confirmed by GC-MS and the calibration curves were validated and contrasted with an HPLC analysis technique disseminated in the literature. It was seen chromatographically that GA and DHA coexists like monomer, dimer or hidrate in solution, which complexes their analysis. Likewise, the pretreatment of the aqueous samples was optimized in order to eliminate water and to assure the complete derivatization of the analytes.

    Hematin, an iron natural protoporphyrin was evaluated in oxidation reactions using both, homogeneous media, and covalently immobilized on polymethacrylate particles. H2O2 was used as oxidizing agent.

    Different reaction conditions were explored, varying the pH of the medium and the concentrations of glycerol, hematin and H2O2. Nevertheless, the conversions attained were low. It is discussed at the same time the ability of glycerol to act as a reducing substrate in the peroxidatic pathway of hematin. Evidence is presented, which indicates that the activated intermediate of hematin preferentially coordinates to a second H2O2 molecule instead of a glycerol one. Thus, molecular oxygen and superoxide radicals are formed, which trigger the irreversible bleaching of hematin. It is also hypothesized that the action of hematin upon glycerol is produced by means of a Fenton process, generated by the release into the solution of iron from its structure during bleaching.

    On the other hand, MnL -a synthetic manganese complex with polydentate Schiff base ligands- did not present catalytic properties in GA production starting from glycerol aqueous solutions treated with H2O2.

    However, it presented catalytic activity in phenol oxidation (peroxidatic pathway) and in the decomposition of H2O2 (catalatic pathway) although just at the beginning of the reaction and stopping rapidly. Since the role of the solvent is crucial to the formation of relevant catalytic intermediates, different solvents were checked, in order to increase the catalytic efficiency. The addition of solvents with high donor numbers like dimethyl sulfoxide and acetone improved the peroxidatic activity of MnL. A scheme of competitive peroxidation and dimerization (inactivation) reactions of the MnL complex is proposed.

    Oxidases enzymes do not require the use of cofactors and are able to oxidize alcohols to aldehydes using oxygen, but they are inhibited by the H2O2 generated as a by-product. Studies were carried out in order to evaluate the catalytic performance in the primary glycerol oxidation of two bi-catalytic systems based on the commercial oxidases galactose oxidase of Dactylium dendroides (GAO) and alcohol oxidase de Pichia pastoris (AOX), both in tandem with hematin, which replaces the catalase enzyme, commonly used to eliminate H2O2 of the system. It is hypothesized that hematin is capable to perform the double function of transform H2O2 either in oxygen or generating a dye in presence of phenol and 4-aminoantipyrine, which is used as a quick detection method for oxidases initial activity. This hypothesis was checked: the effect of the variation of the concentrations of glycerol, enzyme and hematin upon the dye formation reaction rate was evaluated and it was found that the 3 species exert an increase in the reaction rate the higher their concentration. The specific activity on glycerol oxidation was estimated for both enzymes and they were contrasted with those corresponding to their natural substrates. On the other hand, GAO was covalently immobilized to porous polymethacrylate support and different methods to quantify the amount of bonded protein were evaluated. The obtained catalyst was active in the system of coupled reactions, which constitutes an encouraging result since it would enable its reuse and easy recovery between different reaction batches. The evidence presented is convincing. However, it was based on indirect observations obtained during the first reaction minutes.

    For these reasons, oxidation reactions for long times were carried out using the bicatalytic systems oxidase/hematin, but without phenol (as a reducing substrate) or 4-aminoantipyrine. It is hypothesized that hematin exert catalatic action in these conditions, consuming H2O2 and producing O2. The evolution of oxygen concentration during the reaction brought useful information to understand both systems and it was checked that the presence of hematin accelerated its consumption in all cases. The monomer peak of GA was detected in reaction media in systems with GAO, although glycerol conversions were low. The highest GA concentration (94.4 mM in 24 h) was obtained with the system GAO/hematin at pH 9, starting from an initial concentration of glycerol of 1700 mM. This result was also better wirh respect to the use of catalase as co-catalyst. In systems with AOX, conversion degrees of glycerol of 7.4 and 19.5% were calculated, starting from an initial glycerol concentration of 33 mM, although it was only possible to estimate a GA concentration of 3.31 mM after 24 h. Two pathways by which hematin exert its effect were discussed: upon GAO it seems to exert fundamentally a peroxidatic action, reactivating GAO from an inactive state. On the other hand, in presence of AOX, hematin acts through the pseudo-catalatic pathway, which implies the generation of free radicals that finally cause its inactivation. Thus, AOX is left without the necessary protection, rapidly undergoes inactivated as a consequence of the H2O2 generated and the reaction stops.

  • português

    Com a motivação de valorizar a biomassa sob os princípios da química verde, neste trabalho de tese de doutorado catalisadores organometálicos e enzimáticos foram avaliados na oxidação primária de glicerol para a produção das triosas gliceraldeído (GA) y dihidroxiacetona (DHA).

    Estândares de ambas triosas foram avaliadas em testes de atividade antibacteriana em cepas de Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Staphilococcus aureus (ATCC 25922). Verificou-se que o GA era ativo nas três cepas em doses da ordem das dos monoterpenos naturais (6,25 g/L). Por outro lado, o DHA não mostrou bioatividade nas condições analisadas. Essa descoberta amplia as possíveis aplicações dessa substância. Portanto, os experimentos de oxidação foram direcionados à obtenção seletiva de GA.

    A seguir, foi estabelecida uma técnica analítica alternativa para a detecção e quantificação de glicerol, GA e DHA em amostras aquosas, por meio de cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização de chama (GC-FID), que envolve derivatização com um agente silanizante numa etapa. A presença dos analitos sililados foi confirmada por meio de GC-MS e as curvas de calibração foram validadas e contrastadas com uma técnica de análise por HPLC divulgada na literatura. Foi identificado cromatograficamente que cada triosa coexiste em solução como monômero, dímero ou hidrato complexando sua análise. Da mesma forma, o pré-tratamento das amostras foi otimizado para eliminar a água e garantir a completa derivatização dos analitos.

    Hematin, uma protoporfina de ferro natural foi avaliada em reações de oxidação tanto em médio homogêneo, como imobilizados covalentemente em partículas de polimetacrilato. H2O2 foi usado como agente oxidante. Diferentes condições de reação foram exploradas, variando o pH do meio, a concentração de glicerol, hematin e H2O2. No entanto, as conversões alcançadas foram baixas. Ao mesmo tempo, é discutida a capacidade do glicerol de agir como um substrato redutor na via peroxídica da hematin. É apresentada evidência indicando que o intermediário ativado do mesmo coordena preferencialmente com uma segunda molécula de H2O2 em lugar de a uma molécula de glicerol. Dessa maneira, geram-se radicais moleculares de oxigênio e superóxido que desencadeiam o clareamento irreversível de hematin. É ainda hipotetizado que a ação de hematin no glicerol se deva a um processo semelhante ao Fenton gerado pela liberação, em solução, do ferro de sua estrutura durante o clareamento.

    Por outro lado, o MnL - um complexo de manganês sintético com ligantes polidentados à base de Schiff - não mostrou propriedades catalíticas na produção de GA a partir de soluções aquosas de glicerol tratadas com H2O2. No entanto, mostrou atividade catalítica na oxidação do fenol (via peroxídica) e na decomposição de H2O2 para formar O2 (via catalítica), embora apenas no início da reação e parando rapidamente. Dado que o papel do solvente é crucial para a formação de intermediários catalíticos relevantes, diferentes solventes foram verificados, a fim de aumentar sua eficiência catalítica. A adição de solventes com uma capacidade doadora de elétrons, como dimetilsulfóxido ou acetona ao sistema melhorou a atividade peroxídica do MnL. É proposto um mecanismo de reações competitivas de peroxidação e dimerização (inativação) do complexo MnL.

    As enzimas oxidases não requerem o uso de cofatores e são capazes de oxidar álcoois em aldeídos usando oxigênio, mas são inibidas pelo H2O2 gerado como subproduto. Estudos foram conduzidos para determinar o desempenho na oxidação primária do glicerol de dois sistemas bicatalíticos baseados nas enzimas comerciais galactose oxidase de Dactylium dendroides (GAO) e álcool oxidase de Pichia pastoris (AOX), ambas em conjunto com hematin, substituindo a enzima catalase, comumente usada para remover o H2O2 do sistema. Hipotetiza-se que a hematin seja capaz de cumprir a dupla função de converter H2O2 em oxigênio ou gerar um corante na presença de fenol e 4-aminoantipirina, que é usado como um método rápido para detectar a atividade inicial das oxidases. Esta hipótese foi comprovada: foi avaliado o efeito da variação da concentração de glicerol, enzima e hematin nas taxas de formação de tinta e verificou-se que as três espécies exercem um aumento na taxa de reação enquanto a concentração é maior. Assim, a atividade específica na oxidação do glicerol pôde ser estimada, o que foi contrastado com o correspondente aos substratos naturais de ambas as enzimas. Por outro lado, a enzima GAO foi imobilizada por ligações covalentes a um suporte de polimetacrilato e diferentes metodologias foram avaliadas para determinar a quantidade de proteína ligada. O catalisador imobilizado estava ativo no sistema de reação acoplado proposto, o que é um resultado encorajador, pois permitiria sua reutilização e fácil separação dos produtos entre os lotes de reação. A evidência apresentada é esmagadora. No entanto, foi baseado em observações indiretas obtidas durante os primeiros minutos de reação.

    Por esses motivos, as reações de oxidação foram realizadas por um longo tempo com os sistemas bicatalíticos oxidase/hematin, mas sem fenol (como substrato redutor) ou 4-aminoantipirina. Hipotetizase que a hematin exerça ação catalítica nessas condições, consumindo H2O2 e gerando O2. A evolução da concentração de oxigênio durante a reação forneceu informações úteis para compreender os dois sistemas e verificou-se que a presença de hematin acelerou seu consumo em todos os casos. O pico do monômero GA pode ser detectado no meio de reação nos sistemas GAO, embora as conversões de glicerol sejam baixas. A concentração mais alta de GA (94,4 mM em 24 h) foi obtida com o sistema GAO/Hematin para pH 9, iniciando com uma concentração de glicerol de 1700 mM. Este resultado também foi superior em relação ao uso da catalase como co-catalisador. Nos sistemas AOX, foram calculados graus de conversão de glicerol entre 7,4 e 19,5%, a partir de uma concentração inicial de glicerol de 33 mM, embora só fosse possível estimar uma concentração de GA de 3,31 mM após 24 h. Duas maneiras pelas quais a hematin exerce seu efeito foram discutidas: no GAO, parece exercer uma ação fundamentalmente peroxídica, reativando o GAO de um estado inativo. Por outro lado, na presença de AOX, a hematin atua através da via pseudo-catalática que envolve a geração de radicais livres que causam seu clareamento.

    Dessa forma, o AOX fica sem a proteção necessária, se-inativando rapidamente devido ao H2O2 gerado, o que interrompe a reação.