Estudio del papel de PARP-1 en el desarrollo y progresión del cáncer colorrectal
- Autores: José David Puentes Pardo
- Directores de la Tesis: Julio Juan Gálvez Peralta (codir. tes.), Josefa León López (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2025
- Idioma: español
- ISBN: 9788411957632
- Número de páginas: 262
- Tribunal Calificador de la Tesis: Laura García Hidalgo (presid.), Alba Rodríguez Nogales (secret.), Saúl Abenhamar Navarro Marchal (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad de Granada
- Menciones:
- Internacional
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer con mayor incidencia, y el segundo con mayor tasa de mortalidad a nivel mundial. A pesar de que en las últimas décadas se han producido grandes avances en cuanto a la prevención, diagnóstico y mejoras de los tratamientos, éstos no han resultado en mejoras clínicas sustanciales. Esto revela la necesidad de la búsqueda de nuevos biomarcadores con los que mejorar la detección y pronóstico del CCR, así como la potencial respuesta a los tratamientos disponibles o nuevas dianas de tratamiento con el objetivo de desarrollar una medicina personalizada con mayor probabilidad de éxito para el paciente.
La poli-(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1) es una enzima que se caracteriza por la síntesis y transferencia de cadenas ADP-ribosa a distintos substratos. En un principio PARP-1 se relacionó con la reparación del ADN debido a su función en el reclutamiento y activación de las proteínas involucradas en éste. Sin embargo, en los últimos años se ha observado que PARP-1 también está involucrado en la regulación de diferentes procesos biológicos estrechamente relacionados con el cáncer. Además, el hecho de que PARP-1 esté sobreexpresado en distintos tipos tumorales, sugiere un potencial papel en el desarrollo y progresión tumoral. En este sentido se están utilizando inhibidores de PARP-1 (iPARP-1) como tratamiento del cáncer de ovario y mama con deficiencias en los sistemas de reparación del ADN. Sin embargo, algunos de estos pacientes, o en otros tipos tumorales como el CCR no se obtienen los resultados esperados, sugiriendo que la función de PARP-1, y por tanto la respuesta a los iPARP-1 podría depender de otros contextos.
El objetivo principal de este trabajo ha sido describir el potencial papel de PARP-1 en el desarrollo y progresión del CCR a través de la regulación de las células madre cancerígenas (CMC), consideradas por muchos autores como las responsables del proceso de tumorogénesis, en el contexto del estado del supresor tumoral p53, así como su posible mecanismo. Además, se ha determinado si el uso de iPARP-1 es positivo según el contexto de p53 en el CCR.
Para ello hemos analizado el nivel de expresión de PARP-1 en una cohorte de pacientes con CCR, en la que previamente se había evaluado el estado de p53, salvaje (wtp53) o mutante (mtp53). Según nuestros resultados, PARP-1 se encuentró sobreexpresado en el tejido tumoral de los pacientes con CCR independientemente del estado de p53.
A nivel de la supervivencia, se observó una mayor supervivencia global y libre de la enfermedad en aquellos tumores mtp53 con una expresión alta de PARP-1, frente a la expresión baja. Además, en mtp53, la expresión elevada de PARP-1 era un factor pronóstico independiente para la supervivencia. La expresión de PARP-1 se relacionó con tumores pobre y moderadamente diferenciados al analizarlo en toda la cohorte, o en aquellos tumores con wtp53. Dado que dicho grado de diferenciación se asocia con la presencia de CMCs, se analizó la expresión de los marcadores de CMCs CD44 y CD133, encontrándose éstos sobreexpresados. Aunque la expresión de PARP-1 se correlacionó positivamente con la expresión de CD44 y CD133, independientemente de p53, al agrupar la expresión de los dos marcadores y estratificar a los pacientes en CD44CD133 alto y bajo, se observó que la expresión alta de PARP-1 se correlacionaba con la expresión de CD44CD133ALTO al considerar todos los casos o aquellos con wtp53. Además, los niveles de PARP-1 son mayores en el grupo CD44CD133ALTO al tener en cuenta todos los tumores o aquellos wtp53. Esto sugiere una posible regulación diferencial de PARP-1 sobre las CMCs según el estado de p53.
Para corroborar estos resultados, se realizaron estudios in vitro utilizando dos líneas celulares isogénicas de CCR, con diferente estado de p53, HCT-116 (wtp53) y HCT-116 p53 -/- sobreexpresando PARP-1 de forma transitoria. El análisis fenotípico de los marcadores ALDH1 y CD44CD326CD133, y funcional, mediante el ensayo de formación de esferas, de las CMCs mostró diferencias según p53 tras la sobreexpresión de PARP-1. Mientras que en la línea con p53 funcional la sobreexpresión producía un enriquecimiento en los marcadores de CMCs y una mayor capacidad de formación de esferas, en la línea p53 -/- disminuyeron las propiedades de las CMCs tras la sobreexpresión de PARP-1. De esta forma se confirmaron los resultados obtenidos en la cohorte de estudio.
Debido a que PARP-1 regula los ritmos circadianos en condiciones fisiológicas, y la relación entre los ritmos circadianos - p53 - CMCs, nuestra hipótesis era que PARP-1 ejerce su regulación diferencial sobre las CMCs a través de una regulación diferencial de los ritmos circadianos según p53. En la cohorte de estudio se observó una menor expresión de los genes del reloj BMAL1, PER1-3 y REV-ERBß, independiente del estado de p53, a excepción de REV-ERBß en mtp53. En aquellos pacientes con wtp53, una alta expresión de PER1 se correlacionó con una baja expresión de CD44CD133, mientras que una baja expresión de PER3 se correlacionaba con una elevada expresión de CD44CD133, y la baja expresión de CLOCK y REV-ERBß lo hacía con una baja expresión de CD44CD133. Al observar la relación de PARP-1 con los genes del reloj y los marcadores de CMCs, observamos la relación positiva con CLOCK en los tumores mtp53 con baja expresión de marcadores de CMCs. Sin embargo, en los tumores wtp53, PARP-1 se correlacionaba positivamente con REV-ERBß, y negativamente con PER1-2 en tumores con elevada expresión de CD44CD33. Estos resultados sugerían una relación diferencial de PARP-1 con los genes del reloj y los marcadores de CMCs según p53, que podría explicar el efecto sobre las CMCs observado.
Para evaluarlo, se realizó un nuevo modelo in vitro utilizando la línea HCT-116 (wtp53) y HT-29 (mtp53) sobreexpresando PARP-1 de manera estable, y sincronizando los ritmos circadianos antes de cada experimento. Las células wtp53 con sobreexpresión de PARP-1 presentaban una mayor tasa de proliferación, observándose el efecto contrario en la línea mtp53. Estos resultados a nivel de crecimiento tumoral se corroboraron en un modelo murino in vivo de tumores subcutáneos de CCR derivados de las distintas líneas celulares. El análisis del fenotipo de CMCs en el contexto de la sincronización circadiana volvió a mostrar que en la línea wtp53, la sobreexpresión de PARP-1 producía un aumento de los marcadores estudiados anteriormente, de los marcadores LGR5, SOX2, NANOG y OCT3/4, y de la capacidad de formación de esferas; propiedades que se vieron reducidas o no modificadas tras la sobreexpresión en la línea mtp53, confirmando nuevamente los resultados anteriores. La sobreexpresión de PARP-1 en la línea wtp53 provocó una potenciación general del ritmo circadiano de PER1 y REV-ERBß, mientras que lo debilitó en PER1-3 y REV-ERBß en la línea mtp53, lo que explicaría el efecto observado sobre las CMCs, al depender éstas de un ritmo circadiano robusto.
El tratamiento con olaparib, un iPARP-1, disminuyó la viabilidad celular a través del aumento de la apoptosis y la parada en la fase G2/M del ciclo celular. Al analizar su efecto sobre los marcadores de CMCs, se observó que se revierte el efecto observado tras la sobreexpresión de PARP-1 en la línea wtp53. Sin embargo, al analizarlo a nivel funcional se observó una disminución general de la capacidad de formación de esferas, más marcada en las líneas wtp53, pero que en las líneas mtp53 venía acompañado de un cambio fenotípico a uno más agresivo. El olaparib también revirtió la potenciación del ritmo observada tras la sobreexpresión de PARP-1 en la línea wtp53, mientras que en las líneas mtp53 los altera de forma distinta según la expresión de PARP-1.
Finalmente se analizó la expresión de PARP-1 en líneas celulares derivadas de paciente con distinto origen, primario, metástasis y células tumorales circulantes (CTCs). La expresión de PARP-1 fue menor en las CTCs analizadas, lo que concuerda con datos de expresión de otras cohortes de CCR, sugiriendo que ésta podría ser uno del mecanismo para su supervivencia en el torrente sanguíneo.
El tratamiento de líneas metastásicas y CTCs con olaparib u oxaliplatino tuvo un efecto citotóxico dosis-dependiente, presentando las CTCs una mayor resistencia al tratamiento. Además, la combinación de ambos fármacos presentó un efecto sinérgico, observándose a dosis bajas en las líneas metastásicas, mientras que en las CTCs lo hacía a las dosis más altas. Al analizar el efecto sobre la población de CMCs se observó que el tratamiento en líneas con wtp53 redujo esta población, sin embargo, en el contexto de mtp53 generó un enriquecimiento de dicha población.
En base a todos estos resultados, podemos concluir que esta tesis doctoral avanza en el estudio del papel de PARP-1 en el desarrollo y progresión del CCR. PARP-1 se encuentra sobreexpresado en los tumores de CCR, con un efecto distinto según el contexto de p53. Mientras que en los tumores con p53 funcional, PARP-1 favorece el fenotipo de CMCs mediante la potenciación de los ritmos circadianos; en los tumores con p53 mutado, la expresión elevada de PARP-1 es un factor pronostico independiente para la supervivencia, deteriorando el fenotipo de las CMCs mediante una debilitación de los ritmos circadianos. El tratamiento con olaparib revierte y disminuye a nivel funcional las propiedades de las CMCs en células wtp53, y, aunque en las mtp53 tiene un efecto similar a nivel funcional, se promueve un fenotipo más agresivo, perjudicial para el paciente a pesar de su efecto antitumoral en términos de viabilidad. La expresión de PARP-1 varía según el origen de la célula tumoral, siendo menor en las CTCs, lo que podría ser uno de los mecanismos que presentan para sobrevivir en el torrente sanguíneo. Además, el tratamiento con olaparib o combinado con oxaliplatino de las células metástasicas y CTCs, a pesar de su efecto citotóxico, reduce la población de CMCs en el contexto de wtp53, pero lo favorece en el de mtp53.
Esto explicaría la falta de resultados positivos en los tratamientos con iPARP-1 en CCR, al no tenerse normalmente p53 en consideración, y abriría la puerta a estrategias terapéuticas con éste tipo de fármacos teniendo en cuenta el contexto de p53.
