Novel chitinases and hyaluronidases: discovery and application in the synthesis of bioactive oligosaccharides
- Autores: Marina Minguet Lobato
- Directores de la Tesis: Francisco José Plou Gasca (dir. tes.), María Fernández Lobato (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2025
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 198
- Tribunal Calificador de la Tesis: Andrés Rafael Alcántara Leon (presid.), Miguel Angel Rodriguez (secret.), Julia Sanz Aparicio (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Microbiología por la Universidad Autónoma de Madrid
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
- español
Las quitinasas y las hialuronidasas son enzimas que ejemplarizan cómo la modificación de carbohidratos puede ayudar a abordar retos de la sociedad actual. Las quitinasas permiten transformar de forma sostenible residuos industriales que contienen quitina en intermediarios químicos de alto valor añadido, especialmente para aplicaciones biotecnológicas en los sectores de alimentos, medicina y agricultura, contribuyendo así a las iniciativas de economía circular. Por su parte, las hialuronidasas son herramientas esenciales en aplicaciones relacionadas con la salud. Esta Tesis Doctoral presenta avances importantes en el estudio de nuevas quitinasas e hialuronidasas microbianas, centrándose en sus propiedades y aplicaciones, especialmente en la producción de quito-oligosacáridos y oligosacáridos de hialuronato bioactivos.
Se expresaron tres nuevas quitinasas de Metschnikowia pulcherrima, designadas como MpChit35, MpChit38 y MpChit41, en Pichia pastoris. La degradación enzimática de quitina y quitosano generó diferentes mezclas de quito-oligosacáridos, formadas principalmente por (GlcNAc)₂, (GlcNAc)₃ o (GlcNAc)₂-GlcN, cada enzima mostrando patrones de corte únicos.
MpChit35 funcionó como una exo-quitinasa, mientras que MpChit38 y MpChit41 actuaron como endo-quitinasas. Las variantes de MpChit35 obtenidas en este estudio permitieron adaptar la síntesis de mezclas específicas de quito-oligosacáridos. La variante L253R mostró una transición hacia actividad exo-quitinasa y una eficiencia mejorada en la degradación de quitina coloidal. La variante A107D/D151N/A181S/M279A demostró una actividad endo-quitinasa mejorada.
Además, se identificó al hongo Purpureocillium sp. como una nueva fuente de hialuronidasas extracelulares, siendo la enzima PlLya44 fundamental para la degradación de ácido hialurónico de alto peso molecular. Esta enzima tipo liasa, previamente no caracterizada, se expresó en P. pastoris, demostrando una gran estabilidad térmica, y su nivel de producción se escaló exitosamente a 1.0 g/L. PlLya44 actúa mediante un mecanismo endolítico produciendo oligosacáridos de hialuronato insaturados de número par e impar, poco comunes. Además, se desarrolló una nueva metodología para producir mezclas de oligosacáridos de hialuronato con propiedades antioxidantes.
En resumen, esta tesis amplía el repertorio de enzimas activas sobre carbohidratos a través de la expresión, caracterización y modificación de nuevas quitinasas e hialuronidasas, contribuyendo al objetivo general de utilizar la biocatálisis para el desarrollo de soluciones biotecnológicas y la mejora de la salud humana
- English
Enzymes such as chitinases and hyaluronidases demonstrate the potential of carbohydrate-active enzymes to tackle contemporary challenges. Chitinases aid in the sustainable management of industrial waste by converting biomass-based chitin into high-value intermediates for biotechnological applications in the food, medical, and agricultural sectors, thus supporting circular economy initiatives. Hyaluronidases play a crucial role in health-related applications. This Doctoral Thesis advances the characterization of novel microbial chitinases and hyaluronidases, focusing on their properties and applications, especially in producing bioactive oligosaccharides: chito-oligosaccharides and hyaluronan oligosaccharides. Three distinct novel chitinases from Metschnikowia pulcherrima, designated MpChit35, MpChit38, and MpChit41, were expressed in Pichia pastoris. The enzymatic degradation of chitin and chitosan yielded a diverse array of chito-oligosaccharides, primarily (GlcNAc)₂, (GlcNAc)₃, or (GlcNAc)₂-GlcN, with each enzyme exhibiting unique cleavage patterns. MpChit35 predominantly functioned as an exo-chitinase, while MpChit38 and MpChit41 acted as endo-chitinases. The obtained variants of MpChit35 pave the way for tailoring the synthesis of specific chitooligosaccharides mixtures. Specifically, the L253R variant exhibited a shift towards exo-activity and enhanced colloidal chitin degradation efficiency, whereas the A107D/D151N/A181S/M279A variant demonstrated improved endo-activity. Furthermore, the fungus Purpureocillium sp. was identified as a novel source of extracellular hyaluronidases, with the PlLya44 enzyme playing a critical role in degrading high molecular weight hyaluronic acid. This lyase-type enzyme, previously uncharacterized, was expressed in P. pastoris, and its production level was successfully scaled up to 1.0 g/L, demonstrating remarkable thermal stability. Operating via an endolytic mechanism, PlLya44 produced both unsaturated even-numbered and rare odd-numbered hyaluronan oligosaccharides. Additionally, a novel methodology for producing mixtures of hyaluronan oligosaccharides with antioxidant properties was developed. In summary, this thesis expands the repertoire of carbohydrate-active enzymes through the successful expression, characterization, and engineering of novel chitinases and hyaluronidases, contributing to the broader objective of utilizing biocatalysis for the development of biotechnological solutions and improved human health
- español
