Identification and functional analysis of novel sex determining genes in CUCURBITA PEPO
- Autores: María Segura Morales
- Directores de la Tesis: Manuel Jamilena Quesada (dir. tes.), Cecilia Martínez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Almería ( España ) en 2024
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 285
- Títulos paralelos:
- Identificación y análisis funcional de nuevos genes implicados en la determinación del sexo en cucurbita pepo
- Tribunal Calificador de la Tesis: Dolores Garrido Garrido (presid.), Juan Luis Valenzuela Manjón Cabeza (secret.), Pedro Gómez Jiménez de Cisneros (voc.), María del Mar Rebolloso Fuentes (voc.), Antonio Ferrante (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Agricultura Protegida por la Universidad de Almería
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: riUAL
- Resumen
- español
Cucurbita pepo es un cultivo extendido alrededor del mundo, y uno de los que más relevancia económica presenta entre las cucurbitáceas. Como especie monoica desarrolla flores masculinas y femeninas en el mismo pie de planta, y en su desarrollo reproductivo se establecen tres fases diferenciadas: en primer lugar, una fase en la que solo se producen flores masculinas; en segundo lugar, se observa una fase mixta a partir de la aparición de la primera flor femenina (transición a floración femenina); y finalmente, en algunos casos puede aparecer una última fase en la que únicamente se producen flores femeninas. La transición floral femenina y la proporción de flores masculinas y femeninas, lo que se conoce como expresión sexual, condicionan la producción. En función de factores ambientales, hormonales y genéticos, las plantas de calabacín, además de monoicas, pueden ser trimonoicas (plantas que producen flores femeninas, masculinas y bisexuales), andromonoicas (plantas que producen flores masculinas y bisexuales), o androicas (plantas que producen únicamente flores masculinas). Además, se han descrito genotipos ginoicos, que producen sólo flores femeninas o plantas hermafroditas, que sólo producen flores hermafroditas, en otras especies de cucurbitáceas. El desarrollo de los distintos tipos de flores se establece en un programa que implica la expresión coordinada de numerosos genes y que da lugar, a partir de un meristemo hermafrodita o bisexual, a la aparición de una flor masculina, femenina o bisexual. Hasta la fecha, este puzle incluye numerosas piezas que pertenecen a la ruta de biosíntesis y percepción de etileno, indicando el relevante papel que juega esta hormona en la determinación del sexo. Sin embargo, trabajos recientes en melón y pepino han demostrado la existencia de novedosas piezas que conectan elementos previamente descritos. La identificación y caracterización de las piezas que componente el puzle de la determinación del sexo es un objetivo principal de la genética funcional y de la mejora en esta especie.
En esta tesis doctoral se ha rastreado una colección de mutantes de C. pepo para alteraciones en la expresión sexual. Esta estrategia, unida a las herramientas de análisis genómico más actuales como Bulk Segregant Analysis (BSA-seq, por sus sigles en inglés) y la secuenciación completa del genoma (WGS, por sus siglas en inglés), y el análisis transcriptómico (ARN-seq), se emplean para identificar y estudiar la función de algunos genes implicados en la determinación del sexo en C. pepo. Esta estrategia ha llevado a la identificación de nuevos factores de transcripción cuya función es necesaria o limita la producción de flores femeninas.
El análisis transcriptómico comparativo realizado mediante ARN-seq ha resultado ser una herramienta útil para identificar genes candidatos implicados en la determinación del sexo. Este estudio se ha realizado comparando los genes que se expresan en ápices de plantas de calabacín monoicas, y plantas del mutante androico etr1b. Este estudio ha permitido esclarecer los mecanismos moleculares implicados en la determinación y desarrollo de las flores femeninas. Se encontraron un gran número de genes expresados de manera diferencial (DEGs, por sus siglas en inglés) entre plantas que se encontraban aún en fase masculina, y plantas que ya habían transitado a floración femenina. Así mismo se observó que el 25% de esos genes estaban regulados por etr1b, una mutación que reduce la sensibilidad al etileno. El trabajo ha demostrado que estos genes estaban involucrados en la determinación del sexo mediada por etileno, pero también en la biosíntesis y señalización de otras hormonas. Los resultados sugieren un papel negativo de las giberelinas en la floración femenina, mientras que indican que auxinas, ácido abscísico (ABA) y citoquininas actúan como reguladores positivos. Otro tipo de genes muy representados fueron los factores de transcripción de diversas familias, destacando los factores de las familias ERF, NAC, bHLH, bZIP, MYB y C2H2/CH3, muchos de los cuales tienen roles descritos en el control de la floración de forma dependiente o independiente de etileno. Este estudio ofrece una visión amplia de la red regulatoria de la inducción y desarrollo de las flores femeninas de C. pepo, y abre la puerta al estudio de nuevos genes candidatos implicados en este proceso.
La evaluación de la colección de mutantes EMS (Etilmetanosulfonato) de calabacín generada por el grupo de investigación BIO293 de la Universidad de Almería ha permitido identificar dos mutantes afectados en la transición a floración femenina, los cuales presentaron un fenotipo de retraso o pérdida completa de la transición floral femenina. La combinación de fenotipado masivo y de una estrategia de BSA-seq en poblaciones segregantes derivadas de estos mutantes, ha logrado la identificación de las mutaciones causales de ambos fenotipos en los genes que codifican para los factores de transcripción CpCUC2B y CpMYB62.
La caracterización del mutante cuc2b ha demostrado la relevancia de CpCUC2B en la floración femenina. A nivel reproductivo las plantas se caracterizan por producir órganos y meristemos florales ectópicos, suprimir el desarrollo del carpelo y promover el desarrollo de estambres, lo que resulta en un retraso de la floración femenina. cuc2b es una mutación de ganancia de función, pues afecta al sitio de unión del microARN miR164, impidiendo la regulación postranscripcional del gen y haciendo que el gen éste se exprese más que en el WT. Además, la sobreexpresión del gen CpCUC2B va acompañada de una supresión de otros genes CUC también regulados por miR164. El fenotipo de dobles mutantes, portando la mutación cuc2b y las mutaciones de etileno aco1a y etr2b, así como la represión del gen de biosíntesis de etileno CpACS27A en las plantas cuc2b, indican que este factor de transcripción participa en el arresto del desarrollo de carpelos de forma independiente de etileno, y promueve el desarrollo de los estambres suprimiendo la síntesis de etileno.
El mutante myb62 se caracteriza por su fenotipo androico. La caracterización funcional y molecular de la mutación myb62 demuestra que una transición C>T genera un codón de stop prematuro en el gen CpMYB62, y produce una proteína truncada a la que le falta el dominio efector del factor de transcripción. Los tratamientos con hormonas y la medida del etileno producido en plantas WT y mutantes indican que esta mutación impide el desarrollo de flores femeninas inhibiendo la biosíntesis de etileno. Además, el fenotipo androico del doble mutante myb62/etr2b indica que myb62 es epistático sobre etr2b. El análisis transcriptómico de ápices de plantas adultas WT y myb62 confirma la influencia de CpMYB62 en la regulación de genes clave en la determinación del sexo. CpMYB62 aumenta la expresión de genes responsables de la síntesis de etileno (CpACO2B y CpACS27A) y de factores de transcripción que favorecen el desarrollo del carpelo (CpCRC), así como regula negativamente el factor de transcripción CpWIP1, implicado en el arresto del carpelo y promoción del desarrollo de estambres. En la red genética que regula la determinación sexual en Cucurbitaceas, CpMYB62 juega un papel fundamental, siendo el primer gen descrito en C. pepo que actúa aguas arriba de los genes de biosíntesis de etileno temprano, responsables de la promoción del carpelo y el desarrollo de las flores femeninas.
- English
Cucurbita pepo is a worldwide extended horticultural crop. As a monoecious species, it has male and female flowers differentially distributed in three different phases of development: first, a phase in which only male flowers are produced, second, a mixed phase that begins with the occurrence of the first female flower (transition to female flowering) characterized by an alternating production of female and male flowers, and third, a phase in which the plant only produces female flowers. The transition of female flowering and the proportion of male and female flowers, known as sexual expression, determine crop production. Depending on environmental, hormonal, and genetic factors, squash plants can also be trimonoecious (plants develop female, male and bisexual flowers), andromonoecious (plants with male and bisexual flowers), or androecious (plants producing only male flowers). Other sexual morphotypes have also been described in cucurbits, including gynoecious and hermaphrodite plants, which produce only female or hermaphrodite flowers, respectively.
Flower development is set up in a program involving the coordinated expression of numerous genes, resulting in the emergence of a male, female, or bisexual flower from a hermaphroditic or bisexual meristem. To date, this genetic puzzle includes numerous pieces belonging to the ethylene biosynthesis and signaling pathway, indicating the relevant role of this hormone in sex determination. However, recent work in melon and cucumber has demonstrated the existence of novel pieces that connect previously described elements. Identification and characterization of novel pieces in this complex puzzle is a priority objective for functional genetics and breeding in this species.
In this doctoral thesis, a collection of mutants was exploited through direct genetics. This strategy, together with the most up-to-date genomic tools such as Bulk Segregant Analysis (BSA-seq) coupled with Whole Genome Sequencing (WGS), and transcriptomic analysis (RNA-seq) was used to identify and characterize mutants with a sexual development pattern different from monoecy. This strategy has led to the identification of new transcription factors that control the determination of sex in C. pepo.
RNA-seq has demonstrated to be a useful tool to identify candidates involved in sex determination. The study, carried out by comparing genes expressed in the apical shoots of monoecious squash plants and plants of etr1b, an ethylene insensitive androecious mutant line, has shed light on the molecular mechanisms involved in the determination and development of female flowers. A large number of differentially expressed genes (DEGs) were found between plants that were still in the male phase and plants that had already transitioned to female flowering. 25% of those genes were also found to be regulated by ethylene. It is shown that many DEGs were involved in ethylenemediated sex determination, but other were associated with the biosynthesis and signaling of other hormones. The results suggested that gibberellins have a negative role in female flowering, but auxins, abscisic acid (ABA), and cytokinins act as positive regulators of female flowering. Other genes highly represented were transcription factors from various families, especially those belonging to the families ERF, NAC, bHLH, bZIP, MYB, and C2H2/CH3. The study provided a broad view of the regulatory network controlling female flower development in C. pepo and opens the door to investigating new candidate genes involved in this developmental process.
The screening of the squash EMS (Ethyl methasulfonate) mutant collection at the University of Almeria allowed the identification of two mutants affected in the transition to female flowering. The combination of massive phenotyping and a BSA-seq approach in segregating populations derived from these mutants permitted the identification of causal mutations of both phenotypes in transcription factors CpCUC2B and CpMYB62.
Identification and characterization of the cuc2b mutant demonstrated the relevance of CpCUC2B in female flowering. At the reproductive level, plants were characterized by producing ectopic floral organs and meristems, suppressing carpel development, and promoting stamen development, which resulted in the delay of female flowering. cuc2b was found to be a gain-of-function mutation that disrupt the binding site of the microRNA miR164, preventing postranscriptional regulation of the gene and upregulation of the CpCUC2B gene. This was accompanied by the downregulation of other CUC genes also regulated by miR164. The phenotype of double mutants between cuc2b and the ethylene mutations aco1a and etr2b, as well as the repression of the ethylene biosynthesis gene CpACS27A in cuc2b plants, indicated that CpCUC2B is involved in arresting carpel development in an ethylene-independent manner and in the promotion of stamen development by suppressing ethylene biosynthesis.
The EMS mutant myb62 is characterized by its androecious phenotype. The functional and molecular characterization of the myb62 mutation demonstrated that it is a C>T transition that generates a premature stop codon in CpMYB62 transcript and a truncated protein lacking the effector domain of the transcription factor. Hormonal treatments and measurement of ethylene in WT and mutant plants indicated that this mutation prevents the development of female flowers by inhibiting ethylene biosynthesis.
Furthermore, the androecious phenotype of the myb62/etr2b double mutant plants showed that myb62 is epistatic over etr2b. The transcriptomic analysis of the apical shoots of WT and myb62 adult plant confirmed the importance of CpMYB62 in the regulation of key genes in sex determination. CpMYB62 increased the expression of genes responsible for ethylene biosynthesis (CpACO2B and CpACS27A) and of transcription factors that promote (CpCRC) or arrest (CpWIP1) carpel development. In the genetic network that regulates sex determination in Cucurbitaceae, CpMYB62 plays an essential role, being the first gene described in cucurbits that acts upstream of early ethylene biosynthesis genes, responsible for carpel promotion and female flower development.
- español
