Resumen de Studies on RNF8, a ubiquitin ligase with a RING finger domain
Vanessa Plans Calafell
- English
Ubiquitylation is a post-translational protein modification, which regulates very different signaling pathways and biological processes. Ubiquitylation occurs thanks to the catalytic activity of ubiquitin activating enzymes or E1, ubiquitin conjugating enzymes or E2 and ubiquitin ligases or E3 and the substrate can be modified with one or more ubiquitin moieties that form polyubiquitin chains.
The heterodimeric ubiquitin conjugating enzyme (E2) UBC13-UEV mediates polyubiquitylation through lysine 63 of ubiquitin (K63), rather than lysine 48 (K48). This modification does not target proteins for proteasome-dependent degradation. Searching for potential regulators of this variant polyubiquitylation we have identified two proteins, namely RNF8, KIA00675, that interact with UBC13 through their RING finger domains. These domains can recruit, in addition to UBC13, other E2s that mediate canonical (K48) polyubiquitylation. RNF8 has ubiquitin ligase autocatalytic activity that elongates chains through either K48 or K63 of ubiquitin, and UBC13 activity is required to elongate the latter chains. RNF8 and UBC13 co-localize in the nucleus.
RNF8 is a ubiquitin ligase that bears a FHA domain near its amino end, and a RING finger domain at its carboxy terminus, through which it can recruit several ubiquitin-conjugating enzymes. In metazoans, only the mitotic checkpoint regulator CHFR shares this domain architecture. RNF8 follows a cell-cycle-dependent turnover, with levels increasing from G1 to M, reaching a maximum at metaphase, followed by an abrupt decline at anaphase, and recovery of protein levels at the end of mitosis. Overexpression of RNF8 caused a reduction of the G2-M population and an accumulation of cells in G1, while siRNA depletion did not significantly alter the basal cell cycle. Depletion of RNF8 caused a delay in the exit from nocodazole-induced arrest, which was associated with a reduced turnover of the APC/C substrate cyclin B1. Conversely, cells overexpressing RNF8 failed to arrest at G2-M upon treatment with nocodazole. In addition, activation of the spindle assembly checkpoint with a brief exposure to nocodazole in combination with RNF8 overexpression prevented the localization of Mad2 to kinetochores. These functions of RNF8 were dependent on its ubiquitin ligase activity, since a ligase-inactive mutant produced significantly attenuated effects as compared to the wild-type protein. Taken together, these observations suggest that RNF8 is a negative regulator of the spindle assembly checkpoint that reactivates the APC/C under conditions of mitotic stress.
In addition,RNF8 functions as a proapoptotic protein. Ectopic expression of RNF8 in HeLa cells induced the activation of caspases 3 and 8, and the ensuing apoptosis was prevented by incubation with the caspase inhibitors ZVAD and ZDEVD. The apoptotic death induced by RNF8 was greatly attenuated by introduction of a point mutation in its RING finger domain that rendered it non-functional as a ubiquitin ligase, indicating that this function is essential for the proapoptotic activity of RNF8. Treatment with DNA-damaging agents causes a dose-dependent accumulation of endogenous RNF8 without increasing its mRNA levels. Finally, depletion of RNF8 with specific siRNA duplexes effectively prevented the apoptosis and caspase-3 up regulation induced by the topoisomerase II inhibitor etoposide, suggesting that RNF8 plays a major role in regulating apoptotic death caused by DNA damaging agent."
- English
La ubiquitinació és una modificació postraduccional de proteïnes empleada en la regulació de molts tipus diferents de senyalitzacions cellulars i processos biològics. Els enzims responsables daquesta modificació postraduccional són les E1 o enzims dactivació de ubiquitines, les E2 o enzims de conjugació de ubiquitines i les E3 o lligases de ubiquitines i poden conjugar una o més ubiquitines sobre la proteïna substrat.
Lheterodimer format per UBC13-UEV te activitat de conjugació de ubiquitines mitjançant enllaços que utilitzen la lisina en posició 63 de la ubiquitina en contes de la lisina en posició 48. Aquesta modificació no es reconeguda pel proteasoma i per tant no implica una degradació de la proteïna que la porta. La cerca de proteïnes que interactuen amb UBC13 ens va permetre de identificar dues proteines: RNF8 i KIAA0675 que contenen un domini RING finger, pel qual interactuen amb UBC13. RNF8 te activitat autocatalítica de lligasa de ubiquitines, el que li permet elongar cadenes de poliubiquitines tant per lisina 48 com per lisina 63; aquesta darrera depèn de lactivitat catalítica de UBC13. A més, RNF8 co-localitza amb UBC13 en estructures nuclears.
Lestructura en dominis dRNF8 és la mateixa que la del regulador del checkpoint mitòtic CHFR, ambdues proteïnes tenen un domini RING finger de reclutament denzims de conjugació de ubiquitines, al extrem amino terminal i un domini FHA de reconeixement de fosfopèptids. RNF8 localitza en el nucli cellular i te un patró dexpressió depenent de cicle amb uns nivells proteics que augmenten progressivament de G1 a M, assolint un màxim en metafase seguit duna brusca desaparició en anafase i una recuperació de lexpressió de la proteïna en fases més tardanes de la mitosi. La sobre-expressió de RNF8 causa una reducció de la població en G2-M i una acumulació de cèllules en G1. La depleció dRNF8 mitjançant la tècnica de RNAi no causa cap efecte significatiu sobre el cicle cellular basal. En canvi, la depleció dRNF8 causa un retard en la sortida de mitosi després dun arrest induït per nocodazole, fet que sassocia amb una reducció del turnover de la ciclina B1, que és un substrat de lAPC/C. Recíprocament, la sobre-expressió de RNF8 impedeix a les cèllules dacumular-se en G2-M en resposta a un tractament amb nocodazole. A més lactivació del Spindle Assembly Checkpoint (SAC), mitjançant un breu tractament amb nocodazole, en combinació amb la sobre-expressió dRNF8 impedeix que la proteïna del checkpoint Mad2 es localitzi als quinetocors. Aquesta funció dRNF8 depèn de lactivitat lligasa ja que un mutant dRNF8 incapaç de conjugar ubiquitines produeix uns efectes significativament atenuats en comparació amb la proteïna salvatge. Aquestes observacions suggereixen que RNF8 és un regulador negatiu del SAC i permet la reactivació de lAPC/C en condicions destrès mitòtic.
A més, RNF8 presenta activitat pro-apoptòtica. Lexpressió ectòpica dRNF8 en cèllules HeLa activa les caspases-3 i -8 i lactivitat pro-apoptòtica resultant es pot inhibir mitjançant la incubació amb els inhibidors de caspases ZVAD i ZDEVD. La mort cellular induïda per RNF8 es veu atenuada en gran mesura per la sobre-expressió del mutant dRNF8 que no te activitat lligasa de ubiquitines. El tractament amb diferents agents genotòxics provoca una acumulació dosi-depenent de la proteïna RNF8 endògena que no es correlaciona amb un increment dels nivells de transcrit. Finalment, la depleció dRNF8 permet a les cèllules HeLa de ser més resistents al tractament amb etopòsid, suggerint que RNF8 te un paper important regulant la mort cellular causada per aquesta droga.
