Síntesis y evaluación de nuevas bencenosulfonamidas antimitóticas
- Autores: Raúl Fuentes Martín
- Directores de la Tesis: Raquel Álvarez Lozano (dir. tes.), Rafael Peláez Lamamie de Clairac (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Salamanca ( España ) en 2024
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Silvia Perez Silanes (presid.), Laura Gallego Yerga (secret.), Gonzalo Alejandro Vera Namuncura (voc.)
- Materias:
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- Resumen
- español
La tubulina, la proteína fundamental que forma los microtúbulos, es una de las dianas más estudiadas en la búsqueda de nuevos tratamientos contra al cáncer. Los compuestos antimitóticos, como el paclitaxel o los alcaloides de la vinca, son utilizados en la terapéutica actual. No obstante, estos tratamientos a menudo muestran resistencias, lo que conduce al fracaso terapéutico.
Como alternativa, los ligandos de tubulina que se unen al dominio de la colchicina, presentan estructuras más sencillas que facilitan su síntesis. Además, en muchos casos no son sustratos de las bombas de eflujo que causan las resistencias. La combretastatina A-4 (CA4), ligando de referencia formado por dos anillos aromáticos A y B unidos por un puente olefínico, presenta inconvenientes en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas y su inestabilidad configuracional.
El reemplazo del puente olefínico de la CA4 por un grupo sulfonamida mantiene la configuración Z necesaria para la interacción con la diana a la vez que se aumenta la polaridad de la molécula. Hasta el momento, la inmensa mayoría de las sulfonamidas antimitóticas que mantienen como anillo A un 3,4,5-trimetoxifenilo presentan sobre éste el nitrógeno de la sulfonamida. En este trabajo de Tesis Doctoral se han sintetizado 77 nuevas sulfonamidas basadas en la CA4 con la dirección reversa del grupo sulfonamida con el fin de explorar la diferente disposición que pueden adoptar estos ligandos en el sitio de la colchicina. Además, se busca explorar los efectos que pueden tener los sustituyentes en el nitrógeno de la sulfonamida introduciendo una amplia variedad de grupos de diferente polaridad y volumen.
Los compuestos sintetizados se clasifican en tres familias en función del anillo aromático B que presentan: fenilo (familia 1), naftilo (familia 2) e indolilo (familia 3). Todas las nuevas sulfonamidas reversas fueron evaluadas in vitro frente a diferentes líneas tumorales humanas. 25 de las nuevas sulfonamidas presentaron actividad antitumoral con valores de IC50 inferiores a 1 micromolar frente a la línea celular tumoral HeLa. La familia 3, con un anillo indólico como anillo B, es la familia más prometedora con 17 de estos 25 compuestos activos.
Los ligandos de las familias 2 y 3 fueron evaluados adicionalmente frente a nueve líneas celulares tumorales y 3 líneas no tumorigénicas usando una metodología semiautomática durante la estancia predoctoral realizada en el Radiumhospitalet de Oslo. Las líneas MDA-MB468 paclitaxel resistente (PR) y BT474 mostraron cierta resistencia a los tratamientos antimitóticos usados como referencia (paclitaxel, docetaxel, vincristina and vinblastina). Sin embargo, las sulfonamidas indólicas 65, 97, 100, y 102, las cuales portan un grupo cianometilo sobre el nitrógeno de la sulfonamida, no pierden actividad frente a la línea MDA-MB468-PR. Por otro lado, la introducción de un grupo metilo sobre esta posición, sumado a la funcionalización de la posición 3 del indol (96, 101, y 104) parece conferir cierta protección frente a la resistencia de BT474.
La afinidad por las proteínas MDR fue evaluada, demostrando que la mayoría de los compuestos sintetizados no son sustrato de estas bombas. Además, se realizaron estudios del mecanismo de acción sobre una selección de los compuestos más potentes de cada familia.
Los compuestos antimitóticos alteran la dinámica microtubular, evitando el correcto funcionamiento de la mitosis y generando una acumulación de células en esta fase del ciclo. Este efecto fue evaluado por citometría de flujo, al mismo tiempo que se estudiaba la muerte celular mediada por apoptosis. Esta apoptosis también se evaluó midiendo la activación de las caspasas 3 y 7. Por último, la integridad de la red microtubular fue analizada por medio de inmunofluorescencia frente a diferentes líneas celulares.
Todos los compuestos evaluados indujeron acumulación de células en la fase G2/M del ciclo celular, seguido de muerte celular mediada por apoptosis. Estos efectos, sumados a la alteración de la red de microtúbulos tras el tratamiento, sugiere que las nuevas sulfonamidas siguen un mecanismo de acción antimitótico.
Las propiedades farmacocinéticas de los compuestos activos también fueron estudiadas. La solubilidad acuosa de los compuestos de la familia 1 se midió empíricamente. Todos los compuestos estudiados mejoraron la solubilidad acuosa de la CA4, y muchos de ellos la de ABT-751. Por último, resultados in silico de estudios farmacocinéticos y de mutagenicidad demostraron las características favorables de los nuevos ligandos para ser futuros candidatos a nuevos estudios preclínicos.
- English
Tubulin is a crucial component of the mitotic spindle and is commonly targeted in cancer therapy. Antimitotic drugs such as paclitaxel and vinca alkaloids are currently employed against various tumours. However, these treatments often involve resistance, leading to therapeutic failure. As an alternative, many tubulin ligands that bind to the colchicine domain are not substrates for the efflux pumps that cause resistance. Additionally, these ligands have simpler structures that make their synthesis easier. Combretastatin A-4 (CA4), a reference ligand of this domain composed of two aromatic rings (A and B) connected by an olefinic bridge, has drawbacks due to its physicochemical properties and configurational instability. Replacing the olefinic bridge in CA4 by a sulfonamide group preserves the Z configuration necessary for interacting with the binding site and increases the molecule's polarity. Nowadays, most antimitotic sulfonamides with a 3,4,5-trimethoxyphenyl group as A ring have the sulfonamide nitrogen attached to this ring. In this doctoral thesis, 77 new sulfonamides based on CA4 have been synthesized with the sulfonamide group oriented in reverse. This project aims to evaluate the impact of this new orientation at the colchicine binding site and investigate the effects of various substituents on sulfonamide nitrogen. Three families of new reversed sulfonamides emerged from this work, classified by the aromatic B ring: phenyl (family 1), naphthyl (family 2), and indolyl (family 3). All of them were evaluated in vitro against different human tumour cell lines. 25 of the new sulfonamides exhibited antitumor activity with an IC50 lower than 1 micromolar against HeLa cancer cell line. Family 3, with an indole as B ring, is the most promising family with 17 out of these 25 active compounds. The active compounds of families 2 and 3 were evaluated against nine cancer cell lines and three non-tumoral cell lines using a semiautomatic methodology during a short stay in the Radiumhospitalet of Oslo. MDA-MB468-paclitaxel resistant (PR) and BT474 exhibit resistance against the antimitotic drugs used as reference (paclitaxel, docetaxel, vincristine and vinblastine). However, the indole sulfonamides 65, 97, 100, and 102, which feature a cyanomethyl group on the sulfonamide bridge, do not lose activity against MDA-MB468-PR. On the other hand, the introduction of a methyl group on the sulfonamide nitrogen in this family, combined with the functionalization of the 3' position of the indole (96, 101, and 104), results in compounds that are not affected by resistance against BT474. Their affinity for MDR proteins was evaluated, and most of them were not substrates of those proteins. Additionally, the mechanism of action of selected compounds from each family was assessed. Antimitotic drugs interfere with tubulin dynamics, preventing chromosome segregation and arresting cells in mitosis. This effect was evaluated by flow cytometry, as well as the evaluation of apoptotic cell death. Apoptosis was also studied by measuring the activation of caspases 3 and 7. Finally, the integrity of the microtubular network was examined using immunofluorescence against different cell lines. All the tested compounds induced cell cycle arrest at G2/M stage, leading to apoptosis-mediated cell death. These effects, along with the disruption of the microtubular network caused by the treatment, suggest that the new sulfonamides operate via an antimitotic mechanism of action. The pharmacokinetic properties of the active compounds were also studied. The aqueous solubility of the compounds from family 1 was empirically measured. All the compounds studied improved the aqueous solubility of CA4, and many of them also enhanced the solubility of ABT-751. Finally, in silico results from pharmacokinetic and mutagenicity studies demonstrated the favourable characteristics of the new ligands to be potential candidates for future preclinical studies.
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