Resumen de Papel del supresor tumoral p19ARF en la respuesta inflamatoria
INTRODUCCIÓN..........................23 1 INFLAMACIÓN..........................................................................................................................23 1.1 Los TLR (Toll-Like Receptor) y otros sensores de patógenos del sistema inmunitario innato. .............................................................................................................25 1.1.1 Familia de receptores TLR..............................................................................................26 1.1.2 Vías de señalización mediadas por TLR.........................................................................28 Regulación negativa de las vías de señalización de los TLR. .........................................30 1.2 NFB en la respuesta inflamatoria ......................................................................................30 1.3 Citoquinas, mediadores de la respuesta inflamatoria...........................................................32 1.4 Macrófagos en el proceso inflamatorio ..............................................................................33 1.5 Choque séptico y TLR4.......................................................................................................36 2 NUEVOS REGULADORES DE LA INMUNIDAD INNATA: PAPEL DE LOS GENES SUPRESORES DE TUMORES ..........................................................38 2.1 El locus Ink4a/Arf y la proteína ARF..................................................................................39 Locus Ink4a/Arf..............................................................................................................39 La proteína ARF .............................................................................................................40 2.2 Papel biológico de ARF......................................................................................................42 2.2.1 Funciones anti-proliferativas ..........................................................................................42 Supresor tumoral dependiente de p53.............................................................................43 Supresor tumoral independiente de p53..........................................................................44 Anti-proliferativo en el desarrollo...................................................................................44 2.2.2 Función anti-viral............................................................................................................45 2.3 Mecanismos de acción de ARF ...........................................................................................45 2.3.1 Actividad anti-ubiquitina-ligasa y secuestro en el nucleolo............................................45 2.3.2 Sumoilación ....................................................................................................................46 2.3.3 Control ribosomal ...........................................................................................................46 2.3.4 Actividad mitocondrial ...................................................................................................48 2.3.5 Unión a múltiples proteínas celulares .............................................................................48 Índice OBJETIVOS...................................53 MATERIALES Y MÉTODOS......................................................................................................................57 1 MATERIALES........................................................................................................................................57 1.1 Reactivos .................................................................................................................................57 1.2 Animales .................................................................................................................................58 2 MÉTODOS..............................................................................................................................................60 2.1 Análisis de genotipo .................................................................................................................60 2.2 Extracción de DNA de cola de ratón ........................................................................................62 2.3 Obtención de cultivos primarios...............................................................................................62 2.3.1 Aislamiento y cultivo de macrófagos peritoneales .........................................................62 2.3.2 Obtención y cultivo de macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) ......................63 2.4 Cultivo de fibroblastos embrionarios murinos (MEFs) ............................................................64 2.5 Medida de citoquinas en el medio de cultivo ...........................................................................64 2.6 Determinación de la síntesis de NO .........................................................................................64 2.7 Cuantificación de RNA y PCR cuantitativa en tiempo real......................................................65 2.7.1 Aislamiento de RNA.......................................................................................................65 2.7.2 RT-PCR ..........................................................................................................................65 2.7.3 PCR cuantitativa o en tiempo real (Q-PCR) ...................................................................66 2.7.4 Microarray de DNA .......................................................................................................67 2.8 Preparación de extractos citosólico y nuclear...........................................................................68 2.9 Preparación de extracto total. ...................................................................................................68 2.10 Determinación de la concentración de proteínas ......................................................................69 2.11 Análisis de proteínas por Western-Blot....................................................................................69 2.11.1 Electroforesis y transferencia..........................................................................................69 2.11.2 Inmunodetección.............................................................................................................69 2.12 Extracción y preparación de tejidos y tinciones histoquímicas ................................................70 2.12.1 Inclusión de tejidos por congelación y sección en criostato ...........................................70 2.12.2 Inclusión de tejidos en parafina y sección en microtomo. ..............................................70 2.12.3 Tinción de cortes histológicos: Hematoxilina-Eosina (HE)............................................71 2.13 Ensayo de unión al DNA del factor de transcripción NFB (p65)...........................................71 2.14 Preparación de plásmidos.........................................................................................................72 2.14.1 Transformación de bacterias competentes. .....................................................................72 2.14.2 Crecimiento de bacterias transformadas y purificación de plásmidos. ...........................72 Índice 2.15 Transfección de macrófagos.....................................................................................................73 2.16 Transfección de vectores en células HEK293T........................................................................73 2.17 Análisis por citometría de flujo de las poblaciones leucocitarias .............................................74 2.18 Detección de marcadores de superficie mediante citometría de flujo. .....................................74 2.19 Ensayos de adhesión.................................................................................................................74 2.19.1 Adhesión estática ............................................................................................................74 Adhesión celular a proteínas de matriz extracelular. ......................................................74 Co-adhesión celular macrófago-endotelio ......................................................................75 2.19.2 En flujo ...........................................................................................................................76 2.20 Análisis de sangre periférica ....................................................................................................76 2.20.1 Recuento de poblaciones celulares sanguíneas ...............................................................76 2.20.2 Extracción de plasma sanguíneo.....................................................................................76 Cuantificación de citoquinas en plasma..........................................................................76 Análisis de actividades enzimáticas................................................................................77 2.21 Peritonitis inducida con tioglicolato .........................................................................................77 2.22 Edema en oreja de ratón y actividad mieloperoxidasa (MPO) .................................................77 2.22.1 Determinación de la actividad (MPO) en oreja...............................................................77 2.23 Choque endotóxico inducido por LPS......................................................................................78 2.24 Análisis estadístico ...................................................................................................................78 RESULTADOS...............................................................................................................................................81 1 LA AUSENCIA DE p19ARF PROVOCA LA DISMINUCIÓN DE LAS CITOQUINAS INFLAMATORIAS EN RESPUESTA LIGANDOS DE LOS TLR........................................................81 1.1 Respuesta a TLR4 ....................................................................................................................81 1.2 Respuesta a otros TLR .............................................................................................................87 2 EL DÉFICIT DE p19ARF AFECTA A LA LIBERACIÓN DE MEDIADORES INFLAMATORIOS.................................................................................................................................89 3 LA AUSENCIA DE p19ARF DISMINUYE LA ACTIVACIÓN NFB Y LAS MAPK EN MACRÓFAGOS ESTIMULADOS CON LPS. .......................................................................................91 4 LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS TLR EN LOS RATONES p19Arf-/- ESTÁ ALTERADA............................................................................................................................................93 4.1 Regulación de la expresión del locus Ink4a .............................................................................93 4.2 Regulación de la expresión de los TLR....................................................................................96 5 LA SOBRE-EXPRESIÓN DE p19ARF RESCATA EL FENOTIPO DE LAS CÉLULAS p19Arf-/-......................................................................................................................
