Molecular and functional analysis of Cdc14 and PP4 phosphatases in response to DNA damage
- Autores: Adrián Campos Fernández
- Directores de la Tesis: Andrés Clemente Blanco (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Salamanca ( España ) en 2024
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 236
- Títulos paralelos:
- Análisis molecular y funcional de las fosfatasas Cdc14 y PP4 en respuesta al daño del ADN.
- Tribunal Calificador de la Tesis: Félix Machín (presid.), Cristina Martín Castellanos (secret.), João Matos (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Funcional y Genómica por la Universidad de Salamanca
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: GREDOS
- Resumen
- español
Las células están constantemente expuestas a diferentes agentes endógenos y exógenos que pueden producir lesiones en el material genético. De todos los tipos de daño al ADN, las roturas de doble cadena son las más dañinas para la célula. En respuesta a este daño, las células han desarrollado un conjunto de procesos conocidos colectivamente como Respuesta al Daño del ADN (RDA). Uno de los pasos iniciales de la recombinación homóloga (RH) es la resección del extremo del ADN. Esta implica la degradación de una cadena de ADN a ambos lados de la RDA en el sentido 5'-3', generando ADN monocatenario (ADNmc). Posteriormente, diferentes proteínas se unen a este ADNmc, formando un protofilamento capaz de buscar homología e invadir la cadena molde. Si bien muchas proteínas implicadas en estos procesos son reguladas mediante fosforilación por las protein quinasas, se conoce poco sobre el papel de las protein fosfatasas en estos mecanismos. El papel de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) en la regulación de numerosos mecanismos en respuesta al daño del ADN se ha estudiado ampliamente. Dado que Cdc14 es la única fosfatasa conocida que antagoniza a Cdk, es razonable pensar que su función también es crucial en la regulación de estos procesos. Por lo tanto, la ausencia de actividad de Cdc14 conduce a una resección excesiva e inestabilidad genómica, lo que sugiere un papel potencial de la fosfatasa en la regulación negativa de este proceso para restringir temporalmente la progresión de la resección y asegurar una reparación precisa del ADN mediante recombinación homóloga. Además, los análisis de secuenciación de alto rendimiento han permitido la investigación de varios aspectos de la reparación del ADN a nivel de nucleódulos, incluyendo la extensión de la resección, su direccionalidad y los eventos de conversión génica generados durante la reparación de la lesión. Curiosamente, la eliminación de la actividad de Dna2 o la interrupción de sus sitios de fosforilación de Cdk previene el fenotipo de sobreresección observado en ausencia de la fosfatasa, lo que sugiere que Cdc14 regula negativamente la resección al controlar el complejo Sgs1/Dna2. Curiosamente, solo Cdc14 activado mitológicamente (FEAR y MEN), pero no la activación de Cdc14 dependiente de daño al ADN, desfosforila Dna2. Además, la disolución de los focos de Dna2, observada mediante microscopía de fluorescencia, ocurre exclusivamente durante la mitosis, lo que sugiere que solo la activación mitológica de Cdc14 inhibe la resección. En resumen, estos resultados demuestran que el módulo Cdk/Cdc14 funciona como un interruptor molecular que actúa sobre la exonucleasa Dna2 para regular la extensión adecuada de los extremos del ADN monocatenario generados durante la resección, asegurando la restauración precisa de la molécula de ADN.
- English
Cells are constantly exposed to different endogenous and exogenous agents that can produce lesions in the gene7c material. Within all the types of DNA damage, double-strand breaks are the most damaging type of injury to the cell. In response to this damage, cells have developed a set of processes collec7vely known as the DNA Damage Response (DDR). One of the ini7al steps in homologous recombina7on (HR) is DNA-end resec7on. It involves the degrada7on of one DNA strand on both sides of the DSB in the 5'-3’ sense, genera7ng single-stranded DNA (ssDNA). Subsequently, different proteins bind to this ssDNA forming a protofilament capable of searching for homology and invading the template strand. While many proteins involved in these processes are regulated through phosphoryla7on by protein kinases, litle is known about the role of protein phosphatases in these mechanisms. The role of cyclin-dependent kinase (CDK) in regula7ng numerous mechanisms in response to DNA damage has been extensively studied. Since Cdc14 is the only known phosphatase that antagonizes Cdk, it is reasonable to think that its func7on is also crucial in regula7ng these processes. Thus, the absence of Cdc14 ac7vity lead s to excessive resec7on and genomic instability, sugges7ng a potencial role for the phosphatase in nega7vely regula7ng this process to temporally restrain resec7on progression and ensure an accurate DNA repair via homologous recombina7on. Addi7onally, high-throughput sequencing analyses have allowed for the inves7ga7on of various aspects of DNA repair at the nucleo7de level, including the extent of resec7on, its direc7onality, and the gene conversion events generated during lesion repair. Interes7ngly, the removal of Dna2 ac7vity or the disrup7on of its Cdk phosphoryla7on sites prevents the over-resec7on phenotype observed in the absence of the phosphatase, sugges7ng that Cdc14 nega7vely regulates resec7on by controlling the Sgs1/Dna2 complex. Curiously, only the mito7cally ac7vated Cdc14 (FEAR and MEN), but not DNA damage-dependent Cdc14 ac7va7on, dephopshorylates Dna2. Addi7onally, the dissolu7on of Dna2 foci, as observed by fluorescence microscopy, occurs exclusively during mitosis, sugges7ng that only mito7c ac7va7on of Cdc14 inhibits resec7on. In summary, these results demonstrate that the Cdk/Cdc14 module func7ons as a molecular switch that acts on the exonuclease Dna2 to regulate the proper extension of singlestranded DNA ends generated during resec7on, ensuring the accurate restora7on of the DNA molecule
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