Selección y caracterización de cepas de "Streptomyces sp." como agentes de biocontrol frente a "Verticillium dahliae"
- Autores: Carla Calvo Peña
- Directores de la Tesis: Juan José Rubio Coque (dir. tes.), Rebeca Cobos Román (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de León ( España ) en 2024
- Idioma: español
- Número de páginas: 219
- Títulos paralelos:
- Selection and characterization of "Streptomyces sp." strains as biocontrol agents against "Verticillium dahliae"
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús Manuel Cantoral Fernández (presid.), Marcia Barquero Quirós (secret.), Alexander Bernal Cabrera (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biotecnología por la Universidad de León
- Menciones:
- Internacional
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: BULERIA
- Resumen
- español
El hongo Verticillium dahliae constituye uno de los principales patógenos vegetales en el mundo. Infecta a más de 200 especies de plantas diferentes, incluyendo cultivos tan importantes como la patata, el girasol, el algodón o el olivo.
La verticilosis del olivo es considerada actualmente el principal problema biótico para el cultivo del olivo, causando extrema preocupación en el sector del olivar español. Se trata de una enfermedad vascular cuyo agente causal, V. dahliae, provoca el bloqueo de los vasos de xilema causando, a su vez, el marchitamiento de la planta. Esta enfermedad es objeto de investigación desde hace décadas por la dificultad que presenta su control, ya que este patógeno se caracteriza por producir unas estructuras de resistencia denominadas microesclerocios que permiten su supervivencia prolongada en el suelo.
En esta Tesis Doctoral, se ha realizado un aislamiento y caracterización de actinomicetos del género Streptomyces a partir de suelo y material vegetal de un olivar extremeño, para su posterior aplicación en una posible “mezcla supresora” como alternativa novedosa y respetuosa con el medio ambiente para combatir las infecciones causadas por V. dahliae.
Se obtuvieron un total de 202 aislados (96 rizosféricos y 106 endofíticos) de los cuales se seleccionaron 12 como prometedores agentes de biocontrol (BCAs) en base a ensayos in vitro realizados frente a V. dahliae. Estos ensayos permitieron cuantificar la actividad antifúngica de los actinomicetos en medio de cultivo sólido.
Las cepas seleccionadas, 6 rizosféricas y 6 endofíticas, se caracterizaron genéticamente para tratar de identificarlas a nivel de especie mediante un análisis de secuencia multilocus (MLSA). Este análisis permitió determinar que los aislados rizosféricos OR6, OR14 y OR92 eran idénticos y posiblemente pertenezcan a una nueva especie. El aislado OR6 se caracterizó en mayor profundidad y se determinó que su actividad antifúngica era principalmente ejercida por la producción de albociclina. Los aislados OR58, OR67 y OR96 son probablemente también nuevas especies puesto que no presentaron identidad con ninguna otra secuencia presente en las bases de datos.
Con respecto a los aislados endofíticos, el análisis MLSA determinó que los aislados OE79 y OE103 eran idénticos y posiblemente pertenecientes a una nueva especie, el aislado OE69 es indiferenciable de S. castelarensis o S. modarskii, el aislado OE99 se identificó como S. violaceochromogenes y el aislado OE54 se identificó inequívocamente como el productor de rapamicina S. iranensis.
La identificación genética junto con un estudio de inhibición cruzada para analizar posibles interacciones entre las cepas aisladas llevó a la selección final de 6 aislados para la composición de las mezclas supresoras, de los cuales 3 eran de origen rizosférico (OR6, OR58 y OR96) y tres de origen endofítico (OE54, OE57 y OE69).
Para la detección por qPCR de las cepas seleccionadas para la composición de la mezcla supresora, se desarrollaron marcadores moleculares específicos a partir de regiones poco conservadas del genoma. Esta labor se llevó a cabo por dos métodos: la amplificación RAPD, por la que se obtuvieron marcadores para los aislados OR6 y OR96 y la búsqueda in silico de regiones no codificantes en el genoma, por la que se obtuvieron marcadores para OE54.
La capacidad antifúngica de los actinomicetos seleccionados frente al hongo V. dahliae se manifestó también en ensayos en suelo a pequeña escala, donde todos los aislados redujeron ampliamente la viabilidad del patógeno, destacando el aislado OR6, que ejerció una inhibición cercana al 100 %.
Mediante ensayos cromatográficos, se han conseguido identificar algunos de los metabolitos secundarios responsables de la capacidad antifúngica de los aislados. En concreto, la albociclina es la responsable de la mayor parte de la actividad antifúngica del aislado OR6 mientras que la rapamicina es la principal responsable de la actividad antifúngica de los aislados OE57 y OE54, aunque en este último se ha detectado también la producción de ácido antranílico.
Por otra parte, se realizaron estudios para tratar de evaluar el efecto de los actinomicetos en planta mediante la inoculación a través del sistema radicular de plantones de olivo. En este caso, no se pudo valorar el impacto de los agentes de biocontrol desarrollados debido a la dificultad que supone la infección con este patógeno y el tiempo necesario para el desarrollo de la enfermedad. Sí se evaluó, no obstante, el efecto sobre la evolución de las comunidades microbianas del suelo en campo, aplicando las mezclas al suelo de un olivar y realizando posteriormente un análisis metataxonómico de los microorganismos presentes.
Por último, cabe destacar en este trabajo la detección de la especie Pleurostoma richardsiae durante la búsqueda de hongos fitopatógenos en madera de olivo con aparente sintomatología de verticilosis, lo que supuso la detección de este hongo en olivo por primera vez en España.
A modo de resumen, en la presente Tesis Doctoral se ha conseguido aislar microorganismos del grupo de los actinomicetos de gran interés como agentes de biocontrol frente al hongo fitopatógeno Verticillium dahliae que se han caracterizado genética y fenotípicamente y se han podido identificar los compuestos responsables de la actividad antifúngica de los aislados más prometedores. Asimismo, -------------------------------------------------- ----------------------- CONFIDENCIAL --------------------- y se ha detectado el hongo Pl. richardsiae en madera de olivo por primera vez en España.
- English
The fungus Verticillium dahliae is one of the main plant pathogens worldwide. It infects more than 200 species including such important crops as potato, sunflower, cotton and olive.
Verticillium wilt of olive is currently considered the most serious biotic threat for olive cultivation, causing extreme worry in the Spanish olive sector. It is a vascular disease whose causal agent, V. dahliae, blocks the xylematic vessels causing, in turn, the wilting of the plant.
This disease has been the subject of research for decades due to the difficulty of controlling it since this pathogen is characterized by the production of resistance structures called microsclerotia that allow its prolonged survival in the soil.
This Thesis project is based on the isolation and characterization of actinomycetes belonged to the Streptomyces genus from both the rhizosphere and the root system of olive trees and their application in a putative “suppressive mixture” as a novel and environmentally friendly alternative to control infections caused by V. dahliae.
Thus, 202 actinomycetes (96 rhizosphere and 106 endophytic strains) were isolated.
Twelve of them were selected as promising Biological Control Agents (BCAs) according to in vitro assays against V. dahliae. These bioassays allowed us to quantify the antifungal activity of the actinomycetes in solid culture media.
The selected strains were molecularly characterized using multilocus sequence analysis (MLSA) with the aim of obtain a species-level identification. This analysis confirmed that rhizosphere isolates OR6, OR14 and OR92 were conspecific and possibly belong to a new species.
Isolate OR6 was further characterized and albocycline was found to be the main antifungal compound produced by this strain. Isolates OR58, OR67 and OR96 are also putative new species as they did not show identity with any other sequence in the databases.
With regard to the endophytic isolates, MLSA analysis suggested that isolates OE79 and OE103 were identical and could represent a putative new species, isolate OE69 is indistinguishable from S. castelarensis or S. modarskii, isolate OE99 was identified as S. violaceochromogenes, and isolate OE54 was unequivocally identified as the rapamycinproducing S. iranensis.
Molecular identification together with cross interactions analysis led to the selection of six isolates for the suppressive mixture: 3 rhizosphere strains (OR6, OR58 and OR96) and 3 endophytic strains (OE54, OE57 and OE69).
Molecular markers for qPCR actinomycetes detection were designed from poorly conserved regions of the genome using two methods: RAPD amplification for isolates OR6 and OR96 and in silico analysis of non-coding regions in the genome for OE54.
The effectiveness of the selected actinomycetes against the fungus V. dahliae was also demonstrated in small-scale soil tests. All the strains exhibited strong antifungal activity, especially isolate OR6, whose efficacy was close to 100%.
HPLC-MS techniques allowed us to elucidate the main compounds involved in antifungal activity of some isolates. Thus, albocycline was found to be the main antifungal compound produced by isolate OR6 while rapamycin is the main bioactive compound for the antifungal activity of isolates OE57 and OE54, although anthranilic acid production was also detected in OE54.
On the other hand, we carried out assays to evaluate the biocontrol agents as a preventive tool for the management of Verticillium wilt on olive trees. Unfortunately, we were no able to assess the efficacy due to the difficulty of infection with this pathogen and the time required for show symptoms of the disease. However, the effect on the composition of soil microbial communities in the field was evaluated by applying the mixtures to the soil of an olive orchard and then performing a metataxonomic analysis of the existing microorganisms.
Finally, it should be highlighted the detection of the species Pleurostoma richardsiae during the search for phytopathogenic fungi in olive wood with apparent symptoms of Verticillium Wilt. It was the first report of this fungus associated with twig and branch dieback of olive trees in Spain.
In summary, in this Thesis Project have been isolated actinomycetes as promising biocontrol agents for the fungal phytopathogen Verticillium dahliae. These microorganisms have been characterized and some of the most important bioactive compounds have been identified.
In addition, -----------------------------CONFIDENTIAL------------------------------ and the fungus Pleurostoma richardsiae has been detected in olive wood for the first time in Spain.
- español
