C-DI-GMP regulation of cytoplasmic and extracellular proteins in plant-associated bacteria
- Autores: Ariana Casas Román
- Directores de la Tesis: Juan Sanjuán Pinilla (codir. tes.), María Trinidad Gallegos Fernández (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2024
- Idioma: inglés
- ISBN: 9788411954075
- Número de páginas: 283
- Tribunal Calificador de la Tesis: Aroa López Sánchez (presid.), José Antonio Herrera Cervera (secret.), Carlos Medina Morillas (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Fundamental y de Sistemas por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
RESUMEN La agricultura es uno de los factores predominantes que contribuyen a la crisis medioambiental actual. En este contexto, la fijación biológica de nitrógeno (FBN) aparece como un proceso crucial que ofrece ventajas tanto ecológicas como económicas al fomentar la producción agrícola sostenible mediante la reducción de la dependencia en fertilizantes nitrogenados. La simbiosis entre bacterias rizobiales y plantas leguminosas ejemplifica esto, proporcionando una vía ambientalmente sostenible para el cultivo agrícola. Por otro lado, las enfermedades producidas por bacterias fitopatógenas representan una amenaza cada vez mayor para el rendimiento de los cultivos, lo que resulta en pérdidas agrícolas sustanciales. Aunque el resultado es completamente diferente para los dos tipos de interacciones, los mecanismos moleculares implicados en la comunicación entre ambas bacterias y sus plantas huésped parecen ser similares. La presente tesis doctoral se centra en dos bacterias que representan estas interacciones: el simbionte de la judía común Rhizobium etli CE3 (Ret), y la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto).
El segundo mensajero diguanilato cíclico (c-di-GMP) actúa como un mensajero bacteriano que controla la transición entre diferentes tipos de vida, estando involucrado en motilidad, formación de biopelículas y en la secreción de exopolisacáridos (EPS) y proteínas. Este trabajo se centra en proteínas que están diferencialmente reguladas por c-di-GMP en bacterias simbióticas y patógenas, siguiendo un estudio previo realizado por Lorite et al. (2023) sobre el impacto de este mensajero en el proteoma extracelular de R. etli. En un primer enfoque se realizó una comparativa entre niveles fisiológicos y elevados de c-di-GMP de las proteínas encontradas intracelular y extracelularmente en cultivos de Pto. Además de reforzar su implicación en la formación de biopelículas, la producción de EPS y la movilidad, las proteínas exportadas diferencialmente abundantes presentaron tendencias diferentes en las dos bacterias, lo que resalta la complejidad de sus proteomas y su regulación diferencial.
Un hallazgo destacado del estudio sobre Ret fue que una gran parte de las proteínas citoplasmáticas cuya exportación parecía ser promovida por c-di-GMP habían sido reportadas previamente como proteínas moonlighting o multifunción en otros organismos. En el caso de Pto, apareció una tendencia opuesta: la exportación de enzimas metabólicas citoplasmáticas parece disminuir con altos niveles de c-di- GMP. Esto resalta la importancia de la presencia de proteínas citoplasmáticas moonlighting fuera de la célula y la regulación de su exportación. Entre las potenciales proteínas moonlighting citoplasmáticas, el estudio de la gliceraldehído- 3-fosfato deshidrogenasa (Gap) resulta interesante ya que el c-di-GMP promueve su exportación en Ret. Como proteína housekeeping ampliamente conservada y para la que se han descrito funciones moonlighting en una gran variedad de bacterias, Gap aparece como una candidata prometedora para poseer funciones moonlighting similares en los dos tipos de bacterias. Sin embargo, nuestros resultados en Pto han mostrado que la exportación de Gap1 y Gap2 no experimenta cambios significativos bajo niveles altos de c-di-GMP. Sin embargo, su estudio continuó siendo interesante ya que ambas proteínas Gap se encontraron en el extrasoma en diferentes condiciones de cultivo, lo que sugiere la existencia de posibles funciones moonlighting en esta bacteria.
La caracterización genética y funcional de las proteínas Gap presentes en Pto y Ret desveló diversas implicaciones en ambas bacterias. A nivel metabólico, hay una clara disparidad ya que Ret posee una sola proteína Gap responsable de la actividad tanto glucolítica como gluconeogénica, mientras que Pto posee dos enzimas diferentes y no intercambiables para cada actividad, siendo Gap1 glucolítica y Gap2 gluconeogénica. Se ha demostrado que el tercer gen páralogo (gap3/epd) presente en Pto carece de actividad Gap, pero es indispensable para el metabolismo de la vitamina B6, mostrando actividad eritrosa-4-fosfato deshidrogenasa, por lo que se denominó epd. En Pto, ambas enzimas Gap exhibieron características funcionales distintas dependiendo del estado fisiológico de la bacteria. Gap1 ejerce un papel importante en motilidad, producción de biosurfactantes y formación de biopelículas, mientras que únicamente Gap2 parece ser esencial para el crecimiento de la bacteria en plantas de tomate. En Ret, se observó que se necesita una proteína Gap activa en todas las etapas de la simbiosis con su planta huésped, Phaseolus vulgaris. Ambas actividades metabólicas parecen contribuir a la aptitud bacteriana durante las etapas tempranas e intermedias de la interacción, mientras que la actividad gluconeogénica de Gap parece ser crítica para la invasión del nódulo y la fijación de nitrógeno. Aunque la proteína Gap de Ret se secreta de manera relacionada con el c-di-GMP, no se observó ningún efecto en fenotipos relacionados, como la floculación, la formación de biopelículas o la producción de EPS. Curiosamente, a pesar de las diferencias en las proteínas Gap entre las dos bacterias, la similitud de sus genes gap permitió una restauración casi completa del fenotipo silvestre cuando se complementaron intercambiándolas.
El estudio de la exportación de Gap aparece como especialmente interesante ya que su translocación fuera de la célula, que no puede atribuirse únicamente a sus funciones metabólicas primarias, sugiere posibles roles multifuncionales. En el caso de Pto, Gap1 apareció consistentemente exportada independientemente de la composición del medio y de los niveles de c-di-GMP. Por otro lado, Gap2 solo se exportaba en medios específicos y dependiendo de su abundancia intracelular. Estos hallazgos sugieren la probabilidad de roles moonlighting para ambas proteínas; sinembargo, los mecanismos que promueven su exportación siguen siendo desconocidos. En el caso de Ret ya se había detectado que Gap se exportaba diferencialmente bajo altos niveles de c-di-GMP, lo que impulsó al examen de sus posibles mecanismos de exportación. No se encontraron evidencias de la exportación de Gap a través de lisis celular o vesículas de membrana en Ret. Sin embargo, Gap se encontró localizada en el citoplasma y asociada tanto a las membranas internas como externas de la bacteria. Esto, junto con la observación de un aumento en el número de proteoformas extracelulares inducido por c-di-GMP, sugiere la participación de mecanismos de exportación no clásicos o no canónicos. Dado que las modificaciones post-traduccionales (PTM) desempeñan un papel crucial en la exportación y la emergencia de funciones mooonlighting en proteínas citoplasmáticas, se realizaron investigaciones preliminares sobre posibles PTMs presentes en la proteína Gap de Ret, que revelaron la presencia de residuos fosforilados en la proteína Gap intracelular. Estos resultados sugieren un posible vínculo entre el diguanilato cíclico, las PTMs y la exportación de proteínas citoplasmáticas, lo que abre vías para el estudio de otras PTMs que también podrían estar implicadas en los roles moonlighting de la proteína Gap.
En conclusión, esta tesis doctoral aporta nuevos conocimientos sobre el papel del c-di-GMP en la regulación y exportación de proteínas, tanto en bacterias simbióticas como fitopatógenas. Centrándose en las proteínas Gap y sus posibles funciones moonlighting, se destacan las principales similitudes y diferencias entre los dos tipos de bacterias.
SUMMARY Agriculture is a predominant factor contributing to the ongoing environmental crisis. In this context, biological nitrogen fixation (BNF) emerges as a pivotal process offering economic and ecological advantages by fostering sustainable agricultural production through reduced dependence on nitrogen fertilizers. The symbiotic bond between Rhizobium bacteria and leguminous plants embodies this, providing an environmentally sustainable avenue for agricultural cultivation. Conversely, the threat posed by phytopathogenic bacteria-induced diseases increasingly endangers crop yields, resulting in substantial agricultural losses. Although the outcome is completely different for the two types of interactions, common molecular mechanisms that mediate communication between the interacting partners appear to be involved. The present thesis is centered in two bacteria representing these interactions: the common bean symbiont Rhizobium etli CE3 (Ret), and the phytopathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto).
The second messenger cyclic diguanylate (c-di-GMP) acts as a bacterial messenger that controls the transition between different lifestyles, being involved in motility, biofilm formation or exopolysaccharide (EPS) and protein secretion. This work is focused on proteins differentially regulated by c-di-GMP in symbiotic and pathogenic bacteria following a previous study about its impact on the extracellular proteome of Ret by Lorite et al. (2023). In a first approach, a study of the proteins found in the intracellular and extracellular environments of Pto under physiological versus increased c-di-GMP levels was performed. Asides from reinforcing its implication in biofilm formation, EPS production and motility, the differentially abundant exported proteins presented different trends between the two bacteria, which highlights the complexity of their proteomes and the differential regulation therein.
A notable finding from the study on Ret was that a large fraction of the cytoplasmic proteins whose export appeared to be promoted by c-di-GMP had been previously reported as moonlighting or multifunctional proteins in other organisms. In the case of Pto, an opposed contrasting trend emerged: the export of a larger number of cytoplasmic metabolic enzymes appeared to be downregulated by c-di- GMP. Overall, this highlights the importance of the presence of potential moonlighting cytoplasmic proteins outside the cell, and the regulation of their export. Among the potential moonlighting proteins, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gap) was a compelling candidate for involvement of c-di-GMP in its regulation in plant-interacting bacteria, since this second messenger had been found to promote its exportation in Ret. As a widely conserved housekeeping protein with moonlighting functions described in a diverse array of bacteria, Gap appeared as promising candidate for similar functional roles in the two bacteria under study.
Nevertheless, our results with Pto evidenced that the export of Gap1 and Gap2 did not experience significant changes under high c-di-GMP levels. Its study remained interesting, however, as both Gap proteins were found to be exported under different culture conditions, suggesting the existence of potential moonlighting roles also in this bacterium.
The genetic and functional characterization of the Gap proteins present in Pto and Ret uncovered diverse implications in both bacteria. On a metabolic level, there is a clear disparity between the two bacteria since Ret harbours a single Gap protein responsible for both glycolytic and gluconeogenic activities, whereas Pto possesses distinct and non-interchangeable enzymes for each activity, being Gap1 glycolytic and Gap2 gluconeogenic. A third potential paralogue gene (gap3/epd) present in Pto was proved to lack Gap activity but be indispensable for vitamin B6 metabolism displaying erythrose-4-phosphate dehydrogenase activity, thus referred as epd. In Pto, both Gap enzymes exhibited distinct functional characteristics depending on the bacterium physiological state. Gap1 presented a substantial role in motility, biosurfactant production and biofilm formation, whereas only Gap2 appeared to be essential for growth on tomato plants. In Ret, an active Gap protein was found to be required throughout all stages of the symbiosis with its host plant Phaseolus vulgaris. Both metabolic activities appeared to contribute to bacterial fitness during early and intermediate stages of the interaction, whereas Gap gluconeogenic activity appeared to be critical for nodule invasion and nitrogen fixation. Although the Ret Gap protein is secreted in a c-di-GMP related manner, no involvement in free-living c-di-GMP related phenotypes, such as flocculation, biofilm formation or EPS production, was observed. Interestingly, despite the differences in Gap proteins between the two bacteria, the similarity of their gap genes enabled almost complete restoration of the wild type phenotype when interchangeably complemented.
Exploring Gap export presented a compelling research direction since its translocation outside the cell, which cannot be solely attributed to its primary metabolic functions, suggests potential moonlighting roles. In the case of Pto, Gap1 consistently appeared to be exported independently of the medium composition and c-di-GMP levels. Gap2, on the other hand, was only exported in specific media and correlated with its intracellular abundance. These findings underscore the likelihood of moonlighting roles for both proteins, yet, the mechanisms driving their exportation remain elusive. In the case of Ret, Gap had already been detected to be differentially exported under high c-di-GMP levels, which prompted an examination of potential export mechanisms. No evidence of Gap export through cell lysis or membrane vesicles in Ret was obtained. Instead, Gap was located in the cytoplasm but also associated to both the inner and outer membranes, which together with the observed increased number of extracellular Gap proteoforms induced by c-di-GMP, support the involvement of an active mechanism for Gap exportation in Ret. Since post-translational modifications (PTMs) can determine proteoform number and diversity, preliminary investigations into potential PTMs present in the Ret Gap protein were performed, revealing the presence of phosphorylated residues in the intracellular Gap protein. The results suggest a link between c-di-GMP, PTMs and the export of cytoplasmic proteins, which could thereby impact the moonlighting roles of the Gap protein.
Overall, this thesis provides insight into the role of c-di-GMP in protein exportation and regulation in both symbiotic and plant-pathogenic bacteria. Focusing on Gap proteins and their possible moonlighting roles, it highlights the similarities and major differences between the two types of bacteria.
