Anàlisi de mutacions i expressió d'al.lels mutats a la malaltia de Gaucher i la síndrome de Sanfilippo Tipus A
- Autores: Maria Magdalena Montfort Roca
- Directores de la Tesis: Daniel Grinberg Vaisman (dir. tes.), Lluïsa Vilageliu Arqués (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2004
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Silvia Atrian Ventura (presid.), Susana Balcells Comas (secret.), Laura Gort Mas (voc.), Eduardo Tizzano Ferrari (voc.), Miguel Pocoví Mieras (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
La malaltia de Gaucher i la síndrome de Sanfilippo A, anomenada també mucopolisacaridosi IIIA (MPS IIIA), són malalties dacumulació lisosòmica.
En el present treball es mostra la cerca de mutacions responsables de la MPS IIIA en 26 pacients espanyols. Shan identificat 47 dels 52 allels responsables de la malaltia, el que correspon al 90% del allels mutats. La mutació c.1079delC (abans c.1091delC) és la més prevalent entre els pacients dorigen espanyol amb un 36,5% del total dallels mutats. Shan analitzats també quatre polimorfismes interns per a construir els haplotips associats a les mutacions identificades. Hem comprovat que els cromosomes portadors de la mutació majoritària comparteixen el mateix haplotip [T, T, +ins, G], fet que suggereix un origen únic per aquesta mutació.
La cerca de les mutacions responsables de la MPS IIIA serà, i de fet ja ha estat, útil per oferir el diagnòstic molecular a familiars dels pacients afectes per la MPS IIIA. En total, hem realitzat el diagnòstic molecular de 4 possibles portadors i confirmat dos diagnòstics prenatals realitzats enzimàticament.
Hem comprovat la patogenicitat dalgunes de les mutacions identificades. Concretament, les mutacions S66W, R74H, Q85R, R206P, L386R, c.1079delC, R433W i R433Q han estat expressades emprat un sistema basat en lobtenció de baculovirus recombinants mitjançant transposició de lloc específic. Els resultats revelen que totes les proteïnes mutades presenten baixos, sinó nuls, nivells dactivitat malgrat que en les anàlisis de "westerns blot" es detecta tant la proteïna precursora com la madura. Únicament, la sulfamidasa amb les mutacions p.S66W i p.R206P presenta certs nivells dactivitat enzimàtica.
La malaltia de Gaucher està causada per la deficiència en lactivitat beta-glucosidasa àcida. Per tal de determinar la patogenicitat dalgunes de les mutacions responsables de la malaltia de Gaucher identificades en treballs anteriors del nostre grup, sha procedit a la seva expressió en cèllules dinsecte (Sf9). El sistema dexpressió escollit fou el mateix que per lexpressió de la sulfamidasa. Les mutacions P182L, R257X, Y313H, P391L i N392I presenten nivells dactivitat negligibles. Les mutacions N370S, I402T, D409, L444P i els dobles mutants [L444P;E326K] i [N188S;E326K], presenten nivells dactivitat entre el 6% i el 23% respecte la proteïna salvatge. Les N188S i E326K, presenten nivells dactivitat elevats del 42,7% i 66,6%, respectivament. Aquestes mutacions podrien ser considerades com a variants modificadores, les quals al trobar-les soles en un allel no provocarien la malaltia o provocarien uns efectes molt lleus. En canvi, al trobar-les un combinació amb una segona mutació tindrien un efecte additiu incrementant la patogenicitat de laltra mutació.
En el present treball sha avaluat també lefecte del procés de "nonsense mediated decay "(NMD) sobre quatre trànscrits diferents portadors de les següents mutacions: W(-4)X, R257X, c.1098insA i c.1451delAC. Amb lús de diferents tècniques (RT-PCR i digestió; PCR quantitativa; i, el test de la proteïna truncada) hem pogut demostrar que dels trànscrits analitzats únicament els que presenten les mutacions R257X i c.1098insA són degradats pel mecanisme de NMD.
Les dades funcionals i mutacionals obtingudes en el present treball ens ajuden a entendre el mecanisme enzimàtic de la sulfamidasa i de la beta-glucosidasa àcida.
