Vitrificación de espermatozoides caninos: Aplicación en el lobo ibérico (Canis lupus signatus)

• Autores: Joaquín Cerdeira Lozano
• Directores de la Tesis: Mª Jesús Sánchez Calabuig (dir. tes.), Julián Santiago Moreno (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2023
• Idioma: español
• Número de páginas: 93
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ana María Mayenco Aguirre (presid.), Consuelo Serres Dalmau (secret.), Eduardo Roldán Schuth (voc.), Simón Martí Angulo (voc.), Ana Josefa Soler Valls (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Veterinaria por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Ciencias agrarias
    • Producción animal
      • Reproducción
    • Ciencias veterinarias
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    La aparición de nuevos recursos en las técnicas de reproducción asistida, y su creciente aplicación para la conservación de especies amenazadas es el origen de la presente tesis doctoral. El objetivo fue profundizar en la fisiología reproductiva del lobo ibérico (Canis lupus signatus) así como optimizar los procesos de criopreservación de los espermatozoides en esta especie en condiciones de campo, con metodología fácil, aplicable y repetible con el fin de ampliar los bancos de recursos zoogenéticos disponibles para la preservación de esta especie.

    En el primer artículo se comparó la congelación convencional, con diluyentes basados en yema de huevo, glicerol y rampa de congelación lenta, con la vitrificación, empleando el mismo diluyente con yema de huevo pero sin glicerol, y con 250 mM de sucrosa como crioprotector no penetrante. Se evaluaron los cambios producidos por los distintos métodos de criopreservación en los parámetros morfométricos de la cabeza del espermatozoide y en las distintas subpoblaciones morfométricas del eyaculado canino. La congelación convencional produjo una disminución de las dimensiones de la cabeza en la mitad de las subpoblaciones definidas, mientras que la vitrificación determinó un incremento del área de la cabeza del espermatozoide. Asimismo, se realizó una evaluación con microscopia electrónica de transmisión y barrido para describir y evaluar las lesiones ultraestructurales aparecidas en los diferentes compartimentos del espermatozoide y su relación con los distintos procesos de criopreservación. Se observó vacuolización de mitocondrias con ambos métodos y vesiculización de la membrana plasmática y desplazamiento lateral de los microtúbulos con mayor frecuencia en los espermatozoides vitrificados. Dichos hallazgos sugieren que la vitrificación previene la formación de cristales de hielo en el interior de la cabeza, debido a su alto contenido en macromoléculas solubles, pero no en otras regiones espermáticas.

    En el segundo capítulo, se comparó un diluyente para vitrificación, libre de proteínas animales (HTF®), con el mismo diluyente con yema de huevo utilizado en el capítulo anterior. Se evaluó la criorresistencia de espermatozoides, tanto eyaculados como epididimarios, y se analizaron variables de motilidad, integridad de membrana y acrosoma. Los resultados en las muestras epididimarias postcalentamiento mostraron una motilidad total y progresiva que justifican la utilización de este procedimiento como alternativa a la congelación convencional para las muestras epididimarias. El diluyente basado en HTF® permitió obtener los mejores resultados para las muestras con dicho origen.

    En el tercer capítulo, se analizaron las concentraciones de testosterona en plasma sanguíneo de lobo ibérico, para investigar su posible relación con el tamaño de la próstata, el estatus jerárquico y la congelabilidad espermática. Se observaron correlaciones positivas de los niveles de testosterona con el tamaño prostático y el estatus jerárquico. Los animales experimentales categorizados como lobos dominantes tenían tamaños de próstata más grandes que el resto de individuos. Los altos niveles de testosterona no ejercieron un efecto negativo en los índices de criorresistencia. Además, se aplicaron en el lobo ibérico, protocolos de vitrificación espermática, en muestras de espermatozoides eyaculados y epididimarios, a partir de los resultados obtenidos para espermatozoides de perro en los capítulos anteriores. Los resultados obtenidos para los valores cinéticos de motilidad progresiva, fueron similares a los obtenidos para la congelación convencional, al igual que ocurrió con los valores obtenidos para la fragmentación de ADN y morfoanomalías. Estos resultados sugieren que la vitrificación de espermatozoides de lobo ibérico es una alternativa útil a la congelación convencional, pudiendo utilizarse con éxito en programas de conservación ex situ.

  • English

    The development of new resources applied to assisted reproduction techniques, and their increasing application for the conservation of threatened species is the origin of this PhD thesis. Thus, the purpose was to deepen the reproductive physiology of the Iberian wolf (Canis lupus signatus) as well as to optimize the cryopreservation processes of spermatozoa in this species under field conditions, with an easy, applicable and repeatable methodology in order to expand the genetic resources banks available for the preservation of this species.In the first chapter, a conventional freezing procedure using diluents based on egg yolk, glycerol and slow freezing ramp, was compared with the vitrification method based on the same diluent but using 250 mM sucrose as a non-penetrating cryoprotectant instead of glycerol. We investigated the effect of these cryopreservation methods on sperm head morphometric variables and subpopulations of the canine ejaculate. A decrease in head dimensions was observed in half of the subpopulations with conventional freezing and, conversely, an increase of the sperm head area after vitrification was noted. Likewise, an evaluation with transmission and scanning electron microscopy was carried out to describe the ultrastructural lesions in the different compartments of the canine spermatozoa. Both cryopreservation methods produced vacuolization of mitochondria. Vesiculization of the plasma membrane and lateral displacement of microtubules were more frequently observed in vitrified spermatozoa. These findings suggest that vitrification prevents the formation of ice crystals inside the head due to its high content of soluble macromolecules, but not in other cellular regions...