Resumen de Papel del sistema purinérgico en el desarrollo de la corteza cerebral humana basado en un modelo de organoides cerebrales
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The development of the human cerebral cortex is a complex and dynamic process that involves a sequence of closely coordinated genetic, physical, biochemical and environmental events, whose alterations can lead to brain abnormalities collectively referred to as Malformations of cortical development (MCDs) (Guerrini and Dobyns, 2014). In order to design effective therapeutic strategies to counteract the deficiencies associated with MCDs, it is essential to unravel the molecular mechanisms that control the development of the human cerebral cortex. This involves a deep characterization of the main cellular population driving cortical development, the Radial Glia (RG) or neural stem cells (NSCs). However, most studies to date have used animal models or have been carried out on individual populations of human stem cell-derived cortical cell subtypes, rather than analysing as a whole all cell types that constitute the cytoarchitecture of the cerebral cortex (Conti and Cattaneo, 2010, Hansen et al., 2010, Lancaster and Knoblich, 2014b)...
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El desarrollo de la corteza cerebral humana es un proceso complejo y dinámico que implica una secuencia de eventos genéticos, físicos, bioquímicos y medioambientales estrechamente coordinados, cuyas alteraciones pueden llevar asociadas la aparición de anomalías cerebrales que se denominan conjuntamente Malformaciones en el Desarrollo Cortical (MDC). Para diseñar estrategias terapéuticas efectivas que contrarresten las deficiencias asociadas a estas patologías, resulta primordial caracterizar la población celular principal que impulsa el desarrollo cortical, la Glía Radial o células madre neurales (NSCs). En esta tesis doctoral se ha establecido un cultivo 3D de organoides cerebrales humanos, derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSCs), que recapitulan las características del desarrollo cortical humano. Ello nos ha permitido caracterizar la expresión y funcionalidad de los receptores purinérgicos P2X y P2Y a lo largo del desarrollo del organoide. Los receptores P2X, son canales iónicos activados por ligando, y los receptores P2Y, son receptores metabotrópicos acoplados a proteínas G. En mamíferos se han clonado siete subunidades distintas de los receptores P2X (P2X1-P2X7) y ocho subtipos de receptores P2Y (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14). Los receptores P2X son canales homo o heterotriméricos activados por ATP cuya apertura permite el paso de iones Ca2+, Na+ y K+ a favor de gradiente electroquímico. Por otro lado, los receptores metabotrópicos P2Y son receptores que pueden ser activados por ATP, ADP, UTP o UDP y cuya señalización depende de la proteína G a la que se acople el receptor, siendo las más habituales la señalización a través de la fosfolipasa C o de la adenilato ciclasa. Entre las múltiples funciones de los receptores purinérgicos cabe destacar las llevadas a cabo en el Sistema Nervioso Central desde edades tempranas en el desarrollo. Así, participan en distintos procesos durante la neurogénesis, la migración neuronal y el crecimiento axonal, por lo que constituyen unos excelentes candidatos potencialmente involucrados en la modulación de los complejos mecanismos que gobiernan el desarrollo embrionario de la corteza cerebral humana. Tras realizar una caracterización exhaustiva de la expresión de estos receptores, tanto a nivel de ARN mensajero como de proteína, hemos determinado que varios subtipos de receptores P2X y P2Y se encuentran en las distintas fases de desarrollo de los organoides cerebrales, aunque con patrones de localización diferentes. Cabe destacar que los receptores P2X4, P2X7, P2Y1 y P2Y2 se expresan en poblaciones concretas de las estructuras ventriculares presentes en los organoides cerebrales, equivalentes a la corteza cerebral en desarrollo. Para su caracterización funcional y, al resultar imposible realizar un análisis electrofisiológico en organoides completos, se utilizó una adaptación bidimensional del cultivo de organoides para generar rosetas neurales que mimetizan las estructuras ventriculares encontradas en los organoides cerebrales. Esto ha permitido demostrar mediante técnicas electrofisiológicas que los receptores purinérgicos expresados en las diferentes áreas de las estructuras corticales son funcionales y son activados por el agonista fisiológico ATP. Además, el tratamiento de los organoides con una combinación de los antagonistas PPADS+BBG para bloquear toda la señalización purinérgica ionotrópica y parte de la metabotrópica produjo una reducción en el tamaño de los organoides acompañada de una ausencia de formación de estructuras ventriculares. Por otro lado, el tratamiento con el antagonista específico del receptor P2Y1 MRS2179 provocó que los organoides cerebrales tuvieran un mayor tamaño, debido a la formación de una segunda capa de células madre neurales células SOX2+, y que generasen una mayor cantidad de cistos que expresaban TTR, una proteína específica del plexo coroideo.
