Análisis evolutivo de la familia pmt e implicación de la familia row en la patogénesis fúngica
- Autores: María Dolores Pejenaute Ochoa
- Directores de la Tesis: José Ibeas (dir. tes.), Ramón Ramos Barrales (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Pablo de Olavide ( España ) en 2024
- Idioma: español
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química por la Universidad Pablo de Olavide
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: RIO
- Resumen
Las infecciones causadas por hongos patógenos representan una seria amenaza a nivel global, generando pérdidas significativas en la agricultura y en la economía, así como un impacto perjudicial en la salud humana. Como mecanismo para garantizar un suministro suficiente de alimentos y afrontar las pérdidas humanas causadas por las enfermedades originadas por estos patógenos, se ha recurrido a un incremento abusivo en el uso de fungicidas. No obstante, la disponibilidad limitada y el espectro de acción reducido de los fungicidas actuales, sumado a su uso extensivo, han propiciado el desarrollo de cepas resistentes. Con el fin de identificar nuevas dianas antifúngicas, para un posterior desarrollo de tratamientos, y sistemas de control más eficientes y eficaces, el estudio de los mecanismos utilizados por los hongos patógenos para infectar a sus hospedadores se ha convertido en una prioridad en la búsqueda de soluciones a esta problemática.
La interacción entre las plantas y los hongos patógenos es un proceso sofisticado que implica mecanismos complejos por parte de ambos organismos. Los patógenos requieren estrategias de invasión, como el desarrollo de estructuras especializadas y la secreción de proteínas que permitan penetrar la cutícula de la planta, además del desarrollo de sistemas de camuflaje para evitar ser reconocidos por el hospedador. Las plantas, por su parte, requieren la activación de sus mecanismos de defensa frente al patógeno. Durante esta interacción, la pared fúngica desempeña un papel crucial, siendo el primer punto de contacto entre ambos organismos. Por otro lado, la secreción de proteínas y efectores, por parte del patógeno, son claves para que el establecimiento de la patogénesis tenga lugar de manera exitosa. Muchas de las proteínas presentes en la pared celular, así como gran parte de las proteínas secretadas, son glicoproteínas que requieren de una modificación postraduccional, denominada glicosilación, necesaria para su correcta función, localización y actividad. Utilizando como modelo el hongo patógeno del maíz, Ustilago maydis, nuestro laboratorio demostró que las proteínas claves implicadas en los procesos de N- y O-glicosilación son esenciales para el establecimiento de la virulencia de este hongo. En concreto, la deleción del gen gls1, implicado en la ruta de la N-glicosilación, impide la progresión del hongo en el interior de la planta durante las etapas iniciales de la interacción. Por otro lado, la deleción de pmt4, perteneciente a la familia de O-manosiltransferasa (PMT), involucrada en la O-manosilación, es crucial en la formación y progresión del apresorio, estructura necesaria para la penetración de la cutícula vegetal. Curiosamente, la deleción de los otros dos miembros que componen esta familia, pmt1 y pmt2, muestran fenotipos muy diferentes: la ausencia de pmt1 no afecta a la infección, mientras que la eliminación de pmt2 es letal para el hongo. Dada la importancia de la glicosilación para la patogénesis fúngica, y el alto número de proteínas glicosiladas presentes en la pared del hongo y en los procesos de secreción, ambos claves en el desarrollo patogénico, nuestro laboratorio desarrolló una aproximación proteómica destinada a identificar glicoproteínas implicadas en la virulencia de Ustilago maydis.
De este modo, esta tesis doctoral se enfoca en dos objetivos principales relacionados con el estudio de la patogénesis fúngica. El primero de ellos dirigido al estudio de la familia PMT, esencial para el proceso infectivo; y el segundo, destinado a caracterizar glicoproteínas implicadas en virulencia, previamente identificadas en el laboratorio.
Los tres miembros de la familia PMT poseen una secuencia de aminoácidos muy similar y, coherentemente, están involucrados en la misma función, encargándose de adicionar la primera manosa a las proteínas diana. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, la pérdida de cada una de estas proteínas conduce a fenotipos muy divergentes. Con el propósito de comprender mejor las razones detrás de estas diferencias, y explorar el origen de esta familia, el primer objetivo de esta tesis doctoral consistió en realizar un análisis evolutivo y comparativo de los miembros de la familia PMT, con la idea de identificar las posibles razones de su divergencia fenotípica. Nuestros estudios, mostraron que los organismos opistokonta adquirieron la mannosiltransferasa bacteriana, constituida por los dominios PMT-4TMC, probablemente, mediante transferencia lateral de genes (TLG). Tras ello, a esta estructura, se adicionó el dominio MIR, exclusivo de organismos eucariota. Curiosamente, nuestro análisis comparativo de secuencias entre los miembros de la familia PMT reveló la existencia de una región en el dominio MIR de Pmt4, exclusiva de esta proteína y ausente en Pmt1 y Pmt2 y otra región conservada en Pmt1, pero no en Pmt2 ni Pmt4 Estas regiones podrían desempeñar un papel en la especificidad de sustratos de los miembros PMT. Además de ello, observamos que la presencia de un tercer miembro Pmt es exclusiva de hongos, siendo este tercer miembro, Pmt1, y pudiendo haber sido originado a partir de Pmt4.
Para profundizar en el estudio de la patogénesis y descubrir nuevos mecanismos empleados por los hongos patógenos para infectar a sus huéspedes, el segundo objetivo de esta tesis doctoral se enfocó en la caracterización de la proteína Row1, identificada en U. maydis como una glicoproteína implicada en patogénesis y de función desconocida. Esta proteína se induce durante los primeros estadíos del desarrollo patogénico y localiza en la membrana plasmática y en las vesículas secretoras, acumulándose específicamente en el apresorio cuando tiene lugar la formación de esta estructura. La eliminación de row1 reduce la formación de apresorios y presenta defectos en la penetración y proliferación en la planta, lo que resulta en una disminución tanto en el número como en el tamaño de los tumores observados en las hojas de maíz infectadas. Particularmente, los filamentos del mutante deltarow1 presentan una mayor acumulación de Calcoflúor (el cual se une a polímeros de glucano), junto con una mayor resistencia a la degradación por glucanasas, lo que sugiere que el número o composición de los glucanos podría estar afectado. Por otro lado, el mutante deltarow1 también presentó defectos en la secreción de proteínas, relacionadas con la secreción no convencional.
Nuestros datos mostraron que Row1 se encuentra conservado funcionalmente en los patógenos Ustilago hordei y Sporisorium reiliamum, pertenecientes a la familia Ustilaginaceae. Además, Row1 forma parte de una familia de proteínas, a la que hemos denominado familia Row y que consta de seis miembros (Row1, Row2, Row3, Row4, Row5 y Row6) conservados entre los hongos Basidiomycota. La deleción de todos los miembros en U. maydis, a excepción de Row3, mostró una dismunición en la capacidad patogénica del hongo, siendo el triple mutante, obtenido al delecionar los genes row1, row2 y row4, apenas capaz de formar tumores en las plantas de maíz infectadas, y presentando un fenotipo mayor que los observados en los mutantes individuales o dobles (deltarow1deltarow2). Además de ello, la complementación de deltarow1 con una copia extra de Row2 fue capaz de revertir el fenotipo observado en infección, lo que sugiere una redundancia de función entre los miembros de esta familia. Congruentemente, las proteínas Row2 y Row4 presentaron una localización reticular similar a Row1 y el doble mutante deltarow1deltarow2 mostró una pared celular más gruesa que el mutante simple deltarow1, además de una mayor acumulación de Calcoflúor, lo que apoya la idea de que estas proteínas podrían llevar a cabo funciones similares.
Con estos resultados, proponemos que Row1 puede estar involucrado en la secreción no convencional de proteínas y modificar los glucanos de la pared celular de los hongos, siendo necesaria para la correcta formación y penetración de los apresorios a través de la cutícula vegetal. Por otro lado, Row1 forma parte de una familia de proteínas, conservada en hongos patógenos, que podrían desempeñar funciones similares en la virulencia fúngica.
