Ensayo de un sistema de gapmers específico con efecto osteogénico como terapia para el tratamiento de la osteoporosis
- Autores: Daniel García Sánchez
- Directores de la Tesis: José Carlos Rodríguez Rey (dir. tes.), Flor María Pérez Campo (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Cantabria ( España ) en 2023
- Idioma: español
- Títulos paralelos:
- Specific gapmers system assay with osteogenic effect as a therapy for the treatment of osteoporosis
- Tribunal Calificador de la Tesis: Teresa Bellido Bel (presid.), Marta Martín Millán (secret.), Ander Abarrategi López (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad de Cantabria
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
- español
El hueso es un tejido dinámico que se encuentra en constante renovación. Este proceso de renovación es llevado a cabo por dos tipos celulares, los osteoclastos, responsables de la degradación y reabsorción de la matriz ósea, y los osteoblastos, encargados de la síntesis y mineralización de la matriz. En el hueso sano, la actividad de estos dos tipos celulares se encuentra perfectamente equilibrada.
La osteoporosis (OP) es una patología que se caracteriza por una pérdida sistémica de masa ósea, lo que incrementa la predisposición a sufrir fracturas por fragilidad. Esta baja densidad mineral se debe a una exacerbada actividad osteoclástica y a una baja actividad osteoformadora por parte de los osteoblastos.
Los tratamientos disponibles actualmente contra la OP pueden actuar disminuyendo la actividad osteoclástica (tratamientos antiresorptivos), o fomentando la actividad osteoformadora de los osteoblastos (tratamientos osteoanabólicos). Sin embargo, la gran mayoría de estos tratamientos presentan importantes efectos secundarios, en especial si se aplican durante un tiempo prolongado. Por lo tanto, existe una necesidad clínica de encontrar nuevas terapias clínicamente seguras y costoefectivas para el tratamiento de esta enfermedad.
En estudios previos de nuestro grupo de investigación, hemos observado que el silenciamiento de Smurf1, un inhibidor de la ruta de las BMPs, una de las principales rutas de señalización que dirigen la diferenciación de las células madre mesenquimales (MSCs) hacia los osteoblastos, es capaz de promover la actividad osteoformadora de las MSCs. Teniendo esto en cuenta, la hipótesis en la que se sustenta el presente trabajo es que mediante el silenciamiento de otros inhibidores de las principales rutas pro-osteogénicas en MSCs, (ruta de las BMP y ruta de Wnt/ß-catenina), bien de forma individual o en combinación con el silenciamiento de Smurf1, se puede mejorar la capacidad regenerativa de las MSCs endógenas para evitar la pérdida de masa ósea asociada con la OP.
El objetivo de este proyecto es sentar las bases de un sistema terapéutico para el tratamiento de la OP basado en la utilización de un tipo particular de nucleótidos antisentido conocidos como gapmers, dirigidos específicamente a las MSCs endógenas para silenciar uno o más inhibidores de las principales rutas de señalización pro-osteogénicas. Para esto se seleccionaron dos inhibidores de la ruta de las BMPs (SMURF1 y TOB1) y dos inhibidores de la ruta Wnt/ß-catenina (CBY1 y SFRP1).
Tras comprobar satisfactoriamente el silenciamiento de los genes diana mediante el uso de gapmers específicos, se procedió a estudiar el efecto de dicho silenciamiento en el comportamiento normal de las células sin observar alteraciones significativas en la proliferación o viabilidad de las células donde dichos genes se habían silenciado. Sin embargo, mientras que el silenciamiento de Sfrp1 y Tob1 no afectó a la migración de las MSCs, tras el silenciamiento de Cby1 y Smurf1 se observó una disminución significativa en la movilidad celular, como se pudo constatar en un ensayo de cierre de herida.
A continuación, se comprobó in vitro el efecto del silenciamiento transitorio de los genes diana en la capacidad de diferenciación de las MSCs. A pesar de no observar alteraciones significativas en su capacidad de diferenciación adipogénica, el silenciamiento de Sfrp1, individualmente o en combinación con Smurf1, sí incrementó significativamente la capacidad osteogénica de las MSCs. Resultados similares se observaron in vivo, en un modelo ectópico de ratón donde el silenciamiento del Sfrp1 presentó mayores niveles de formación de nueva matriz ósea.
Debido a que el efecto terapéutico de las MSCs no depende únicamente de su potencial osteogénico sino también de su acción paracrina, se comprobó el efecto del secretoma de las MSCs transfectadas con el gapmer de Sfrp1 sobre el metabolismo óseo. Tras exponer a osteocitos al medio condicionado obtenido de MSCs que habían sido previamente transfectadas con el gapmer para el silenciamiento de Sfrp1, se pudo comprobar una tendencia a disminuir la expresión de los inhibidores osteoblásticos Sost y Dkk1, así como una disminución en el ratio de expresión Rankl/Opg, indicando una potencial disminución de la disponibilidad del RANKL de origen osteocítico, lo que produciría una menor actividad osteoclástica. Los experimentos realizados en cultivos ex vivo de discos de hueso del cráneo de ratones, mostraron resultados similares. Se comprobó que el medio condicionado de MSCs donde se inhibió la expresión de Sfrp1, no solo disminuyó significativamente el ratio de expresión de Rankl/Opg, sino que también produjo una disminución significativa en la expresión de marcadores de diferenciación y actividad osteoclástica.
Tras estos resultados, se eligió Sfrp1 como la mejor diana terapéutica entre las estudiadas. Por lo tanto, se procedió a estudiar la eficacia de un sistema terapéutico basado en la utilización de ese gapmer, encapsulado en nanopartículas lipídicas funcionalizadas con aptámeros (NPs-Apt) diseñados para dirigir específicamente dichas nanopartículas a las MSCs de la médula ósea. Los aptámeros, o anticuerpos químicos, son oligonucleótidos de cadena sencilla con capacidad para adquirir una estructura tridimensional que les permite reconocer una diana específica. La eficacia de este sistema terapéutico se probó in vivo mediante administración localizada intraósea en un modelo osteoporótico de ratón como tratamiento preventivo frente a la OP. Se observó que, a pesar de presentar menores niveles de hueso trabecular al compararlos con ratones no osteoporóticos, los animales que recibieron el gapmer de Sfrp1 presentaban niveles de masa ósea de hueso trabecular intermedios entre el control sano y el control osteoporótico, indicando un efecto osteoprotector del nuestro sistema. La administración sistémica del sistema de NPs-Apt en ratones, no solo permitió observar la efectividad del aptámero para dirigir el sistema de NPs hacia el hueso evitando su secuestro en otros órganos, sino que además demostró que su uso como mecanismo de transporte para un gapmer de Sfrp1 en un modelo osteoporótico de ratón, con administraciones sistémicas periódicas, fue capaz de incrementar la calidad del hueso trabecular de los ratones tratados.
Con la vista puesta en la futura aplicación en humanos, se procedió a probar la eficacia del silenciamiento de SFRP1 en MSCs de individuos osteoporóticos, que tienen de por sí una capacidad osteogénica reducida. Comprobamos que MSCs aisladas de la cabeza femoral de pacientes osteoporóticos transfectadas con el gapmer de SFRP1 presentaban una capacidad osteogénica significativamente más alta que las MSCs transfectadas con el gapmer control. Nuestros resultados muestran que la inhibición transitoria de Sfrp1 mediante gapmers específicos es capaz de aumentar la capacidad osteogénica de las MSCs tanto in vitro como in vivo utilizando un sistema terapéutico de nanopartículas dirigidas a las MSCs mediante el uso de aptámeros.
- English
Osteoporosis (OP) has become a silent global epidemic mainly affecting people over the age of 50. This represens a significant financial burden to healthcare systems worldwide. Considering the limitations and side effects associated to current OP treatments, the aim of the present work has been to lay the groundwork for the development of cost-effective and safer treatment options for patients. In this work we observed that transient silencing of inhibitors of the Wnt and BMP signaling pathways, achieved by the use of fourth-generation antisense oligonucleotides known as Gapmers, produce a significant increase in the osteogenic capacity of mesenchymal stem cells. Among the targeted inhibitors, both the in vitro and in vivo effects of Sfrp1 silencing, alone or in combination with Smurf1, showed the most promising results for a future design of a new therapeutic approach for the treatment of OP.
- español
