Análisis de dominios funcionales del transportador ABC de Saccharomyces cerevisiae, Ycf1p, mediante mutagénesis dirigida y supresión intragénica
- Autores: Juan Manuel Falcón Pérez
- Directores de la Tesis: Pilar Eraso Mazmela (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 1999
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alonso Rodríguez Navarro (presid.), Miguel Remacha Moreno (secret.), Jesús Solera García (voc.), Juana Maria Sempere Condere (voc.), Juan José Aragón Reyes (voc.)
- Materias:
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- Resumen
La proteína vacuolar Ycf1p (Yeast Cadmium Factor) está implicada en la resistencia a Cd2+ y a otras sustancias tóxicas que son conjutadas con glutation en Saccharomyces cerevisiae. Pertenece a la familia de transportadores ABC (ATP Binding Cassette) que incluye proteínas humanas como CFTR (Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator) y MRP1 (Multidrug Resistance-associated Protein).
El objetivo de este trabajo ha sido profundizar en el estudio de las relaciones estructurales y funcionales de la proteína Ycf1p.
En una primera aproximación se crearon mediante mutagénesis dirigida veintidós mutaciones únicas en residuos conservados de los dominios de unión a nucleótidos (NBD1 y NBD2), transmembrana (TMD2) y regulador (R) de la proteína.
La caracterización de los mutantes ha llevado a la identificación de residuos esenciales para la biogénesis (Ile711, Leu712, Phe713, Glu927 y Gly1413), para la función (Gly663, Gly756, Asp777, Gly1306 y Gly1311) y para la regulación (Ile840, Tyr855, Ala910 y Arg1143) de Ycf1p. Una segunda aproximación ha consistido en el análisis de supresión intragénica de cinco mutaciones localizadas en los dominios NBD1 (G663V, G756D y D777N) o NBD2 (G1306E y G1311R) e implicadas en la unión y/o hidrólisis de ATP. Todos los revertientes de los mutantes G663V, G756D, G1306E y G1311R resultaron ser reversiones de la mutación primaria a la secuencia silvestre.
En cambio se han aislado trece mutaciones supresoras de la mutación D777N localizadas en los dominios: TMD1 (V5431I y F565L), TMD2 (A1003V, A1021T, A1021V, N1027d, Q1107R, G1207D, S1212L y W1225C), NBD1 (S674L) y NBD2 (R1415G). Esta localización demuestra la interacción física y/o funcional de NBD1 con los otros tres dominios.La caracterización de los mutantes supresores indica que el mecanismo de supresión implica una alteración en la especificidad de sustrato.
