Análisis del endobacterioma asociado a Rubus ulmifolius Schott, evaluación del potencial antifúngico del volatiloma bacteriano vinculado y estudio de la influencia de cepas de los géneros Arthrobacter y Rhizobium en la variación de la expresión génica relacionada con la tolerancia al estrés oxidativo en el modelo in vivo Caenorhabditis elegans
- Autores: Rocío Roca Couso
- Directores de la Tesis: Raúl Rivas González (dir. tes.), José David Flores Félix (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Salamanca ( España ) en 2024
- Idioma: español
- Títulos paralelos:
- Analysis of the Rubus ulmifolius Schott associated endobacteriome, antifungal potential evaluation related with bacteria} volatilomes and study of Arthrobacter and Rhizobium strains influence on the gene expression variation related to oxidative stress tolerance of the in vivo model Caenorhabditis elegans
- Tribunal Calificador de la Tesis: Beatriz R. Vázquez de Aldana (presid.), Zaki Saati Santamaría (secret.), Jorge Gutiérrez Merino (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Microbiología y Genética Molecular por la Universidad de Salamanca
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- Resumen
- español
La población humana está en constante crecimiento y, a partir de la Revolución Industrial, experimentó un incremento exponencial descontrolado. La agricultura es la base de la alimentación humana y, para satisfacer la continua demanda de alimentos, ha tenido que evolucionar y mejorar para conseguir cultivos más eficientes. Los fertilizantes y pesticidas químicos son dos de los factores más importantes en la agricultura que aportan los nutrientes necesarios a los cultivos y los protegen de las enfermedades. El uso de los fertilizantes y de los pesticidas ha ido en aumento desde su incorporación a la agricultura. Entre el año 2000 y el 2021, el consumo mundial de fertilizantes aumentó en un 144,3%, mientras que el consumo de los pesticidas aumentó en un 162,3%. En la actualidad, se han descrito una serie de consecuencias negativas relacionadas con la salud ambiental y la humana, derivadas del uso excesivo de los compuestos agroquímicos. El exceso de estos productos que no son absorbidos por las plantas, son acumulados en los suelos. Estos, ya sea por la lluvia, la erosión del suelo, el riego o la infiltración, acaban en las aguas subterráneas y los acuíferos, lo que altera las características fisicoquímicas del agua y la contamina. Además, el uso excesivo de los pesticidas químicos ha dado lugar a la aparición de cepas de microorganismos fitopatógenos resistentes a estos compuestos, los cuales acaban perdiendo su efectividad y capacidad de control. Por esta razón, en los últimos años, las diferentes legislaciones gubernamentales y supragubernamentales se han vuelto más estrictas con respecto al uso de este tipo de compuestos químicos, por lo que es necesaria la búsqueda de alternativas más sostenibles. Una de las alternativas propuestas es el uso de bioestimulantes o biopesticidas. Por un lado, los bioestimulantes son compuestos formulados en base a microorganismos PGP (Plant Growth Promotion) que poseen diferentes mecanismos de acción que inducen el crecimiento vegetal. Por otro lado, los biopesticidas son formulados en base a microorganismos que poseen actividad antagonista frente a algún fitopatógeno, ya sea porque lo combaten o porque previenen la infección. La mayoría de estos microorganismos con interés agronómico utilizados para estos fines provienen o bien de los suelos, ya que están relacionados con la fertilidad y la productividad del suelo; o bien del interior de los tejidos vegetales, pues son organismos capaces de establecer relaciones ás estrechas con las plantas que los microorganismos edáficos. En este sentido, tanto los microorganismos edáficos como los que habitan en el interior de las plantas, llamados endófitos, pueden tener un rol activo en el mantenimiento de los sistemas agrícolas. El estudio de estos microorganismos y de sus interacciones con las plantas puede abrir nuevas puertas al desarrollo de nuevos bioestimulantes o biopesticidas. Los microorganismos del suelo desempeñan funciones que son esenciales para el mantenimiento de los ecosistemas. Además, inducen el crecimiento de las plantas y mejoran la salud vegetal, por lo que son considerados como un importante recurso para el mantenimiento de la sostenibilidad en los sistemas agrícola. La interacción entre las plantas y los microorganismos del suelo no es unidireccional, ya que las plantas también influyen en la microbiota edáfica. En este sentido, diversos estudios apoyan la teoría de que las plantas reclutan a microorganismos específicos mediante la liberación de exudados, que las ayudan en la adquisición de nutrientes y la mitigación de estreses tanto bióticos como abióticos. Estos microorganismos pueden colonizar los tejidos de la planta y establecerse en su interior, pasando a ser considerados microorganismos endófitos, los cuales ahora conforman el microbioma de la planta. Este conjunto de microorganismos está involucrado en el mantenimiento del estado de la salud y la nutrición óptima de la planta. El origen de los microorganismos que interaccionan con las plantas es diverso. La mayoría son reclutados a partir del suelo circundante, y conforman la microbiota rizosférica de la planta, mientras que otros provienen del ambiente aéreo y tienen una influencia determinante sobre la microbiota filosférica, en la superficie de los tejidos vegetales. Tanto los microorganismos que conforman la rizosfera como los que conforman la filosfera pueden acabar colonizando el interior de las plantas y así establecerse en la endosfera. Para ello, deben de atravesar y de penetrar los tejidos vegetales. Las estimaciones indican que el suelo rizosférico es el contribuyente mayoritario de la microbiota endófita de las plantas,contribuyendo con más de dos tercios de la diversidad bacteriana y la fúngica. Además, la composición de los ambientes endofíticos es diversa, variando no solo entre las plantas sino también entre los compartimentos de un mismo individuo. Dado que estos microorganismos están intrínsecamente ligados a la planta, es probable que muchos de ellos posean mecanismos beneficiosos para las plantas. Sin embargo, muchas de estas funciones siguen sin estar caracterizadas. Las nuevas técnicas de secuenciación masiva evitan algunas de las limitaciones asociadas al cultivo de microorganismos ya que permiten analizar toda la comunidad, incluidas las células que están inactivas. Estos microorganismos pueden contar con diferentes mecanismos que sirvan para el desarrollo de bioestimulantes o biopesticidas. Por un lado, los bioestimulantes cuentan con mecanismos de promoción del crecimiento vegetal, que facilitan la adquisición de nutrientes como el nitrógeno, el fósforo, el potasio o el hierro o intervienen en la regulación hormonal de la planta. Por otro lado, los biopesticidas cuentan con mecanismos de protección frente a patógenos, como la producción de moléculas antibióticas o la inducción de la resistencia sistémica en la planta.
- English
Chemical fertilizer and pesticides have been two of the key factors in modern agriculture. Currently, the overuse of the agrochemical compounds has resulted in the development of environmental and human health related negative consequences. For these reasons, in recent years, governmental and supragovernmental legislations have become stricter regarding the use of this type of chemical compounds, clamouring to search for more sustainable alternatives. In this sense, the use of rhizospheric and endophytic microorganisms has been proposed since they may have an active role in the agricultural systems maintenance.
The main objective of this doctoral thesis is the study of the bacterial communities associated with the inner tissues of Rubus ulmifolius Schott and the isolation of endophytic bacteria for the evaluation of their potential use as bioinoculants, the evaluation of their potential use as biopesticides against phytopathogenic fungus Botrytis cinerea and the evaluation of its potential use as blackberry production enhancers.
During the first chapter, the bacterial diversity within root, stem and leaves of blackberry plants, Rubus ulmifolius Schott, was evaluated. Samples were taken from several blackberry plants located in three different environments which were influenced by different environmental factors. The results obtained during this chapter revealed that the bacterial composition of Rubus ulmifolius plants was essentially the same in the same tissues across different environments while differences in composition were observed among different tissues of the same plant. Among the different tissues, the higher the sample was in the plant, the lower the diversity was. Furthermore, taxa composition was uniform among root samples from different environments, but stem and leaf samples showed some specific taxa enrichment. This is the first time that endophytic bacteria composition of Rubus ulmifolius plants across different tissues and environment has been evaluated.
During the second chapter, a set of endophytic bacteria from the inside of root and stem samples was isolated. Furthermore, in this chapter we carried out the identification of the isolates based on their protein profile and based on the 16S rRNA gene sequencing. This evaluation allowed the description of a new bacterial genus, called Ferranicluibacter rubi.
During the third chapter, the ability to promote plant growth of the 70 strains was evaluated through several approaches. First, plant growth promotion related mechanisms were evaluated in vitro. Additionally, the colonization ability of the strains was also studied in vitro by carrying out hydrolytic enzyme production and biofilm production assays. Subsequently, both the plant growth promotion and colonization abilities of the selected strains were evaluated in vivo assays with tomato plants. In silico studies of genomes also provide valuable information about the different pathways that may be involved in the previously performed in vivo assays.
During the fourth chapter, the biopesticide potential against the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea of the 70 isolated strains was evaluated through several approaches. Firstly, the production of hydrolytic enzymes, the direct action of the bacteria against the fungus and the indirect action of the bacterial volatilome against the fungus were evaluated in vitro. Next, the biofungicide potential of the selected strains was evaluated in vivo on tomato plants. Four of the analysed strains presented a volatilome with a great antifungal potential. In this sense, the genome of the selected strains was evaluated for the biosynthesis of volatile compounds with reported antifungal activity. Since all the selected strains seemed to have the potential to produce volatile compounds with antifungal activity, the composition of their volatilome was analysed through the HS-SPME-GC-MS (Headspace Solid Phase MicroExtraction coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry) technique. Finally, in this chapter we wanted to study whether the antifungal activity shown in vivo could be due to the activation of systemic resistance in the plant.
During the fifth chapter, it was evaluated the use of the selected strains to improve the blackberry fruit production of Rubus sp. crops both in greenhouse and in field conditions. During greenhouse conditions assay, the chlorophyll content prior to flowering was evaluated. The number of flowers per plant, the number of fruits per plant and the average fruit weight per treatment were also evaluated. Blackberries phenolic composition was also evaluated after greenhouse trial. All these compounds identified in blackberries are responsible for the nutraceutical properties associated with the consumption of this type of fruit. For this reason, we wanted to determine if the observed differences in phenolic compounds concentration among the different blackberries obtained from the greenhouse trials could be related with the increment of heat stress tolerance in model organism Caenorhabditis elegans. The results showed an improvement in the survival rate in those nematodes exposed to extracts of blackberries obtained from inoculated plants. These observed effects may be due to the activation of some metabolic pathways in the Caenorhabditis elegans organism related to oxidative stress tolerance. Therefore, in this chapter we evaluated whether the exposure of nematodes to blackberry extracts activated the expression of several genes involved in the insulin signalling pathway (IIS), one of the main routes involved in the regulation of oxidative stress. The trial under field conditions was carried out only with the most promising bacteria. Phenolic content and different production and composition parameters of the collected blackberries were studied, such as the number of fruits per plant, blackberry size, blackberry acidity, humidity and ashes percentages and several colorimetric parameters.
In sum, this thesis highlights the benefits of using endophytic bacteria in agricultural crops, which not only represent an advantage for farmers, who would obtain more efficient crops, but also for consumers, as they would obtain fruits of higher nutritional quality.
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