Applications of CRISPR/Cas technology and nanovehicles in the edition and detection ofpathogenic mutations

• Autores: Carmen Escalona Noguero
• Directores de la Tesis: Begoña Sot Sanz (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2023
• Idioma: español
• Número de páginas: 459
• Títulos paralelos:
  • Aplicaciones de la tecnología CRISPR/Cas y los nanovehículos en la edición y detección de mutaciones patógenas
• Tribunal Calificador de la Tesis: María Dolores Blanco Gaitán (presid.), María José Feito Castellano (secret.), Daniela Palacios García (voc.), Marta Gloria Dueñas Porto (voc.), Sandra Rodriguez Perales (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Genética
      • Ingeniería genética
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    La tecnología CRISPR/Cas ha revolucionado la edición génica. Las nucleasas CRISPR componen un conjunto de versátiles herramientas que ya se ha empleado para la generación de knock-in y knockout, edición de bases y modulación transcripcional. Además, algunas proteínas Cas, como Cas12a, poseen una actividad trans adicional que puede utilizarse para detectar ácidos nucleicos. El sistema CRISPR/Cas resulta, por tanto, muy prometedor tanto para el tratamiento como para el diagnóstico de numerosas enfermedades. Este proyecto, centrado en las nucleasas Cas12a y Cas9, explora ambos aspectos. Los trastornos genéticos son la diana principal de las terapias CRISPR. Se trata de un grupo heterogéneo de enfermedades que provocan elevada mortalidad y morbilidad a nivel mundial. La capacidad de las nucleasas Cas para cortar el ADN de manera específica allana el camino para la modificación selectiva de las alteraciones causantes de dichos trastornos. Esta modificación puede ocurrir a través de dos vías diferentes de reparación del ADN que se activan tras el corte: la unión de extremos no homólogos y la reparación dirigida por homología. La primera puede aprovecharse para interrumpir la expresión de genes patógenos, mientras que la segunda permite editar genes de manera precisa, lo que puede emplearse para corregir mutaciones patógenas. En esta tesis, hemos explorado el potencial terapéutico de ambas vías, centrándonos especialmente en el problema de la entrega de proteínas CRISPR. Para ello, el primer paso ha sido implementar un protocolo para la purificación de Cas12a y Cas9, así como una serie de ensayos para validar su actividad nucleasa tanto ex cellullo como in cellullo. Existen varios métodos para la entrega de proteínas CRISPR in vitro y ex vivo. Sin embargo, la mayoría de aplicaciones terapéuticas requieren entrega in vivo y, en este sentido, la membrana citoplasmática y el atrapamiento endosomal constituyen importantes barreras. Para abordar este reto, hemos empleado dos estrategias complementarias. Por un lado, hemos diseñado diferentes variantes de Cas12a para evitar el atrapamiento endosomal. Por otra parte, dado que el transporte de proteínas libres suele ser ineficiente, hemos optimizado un protocolo para la interacción de las proteínas Cas12a y Cas9 con nanopartículas magnéticas (MNP). Los nanomateriales se han utilizado ampliamente como vehículos para una gran variedad de biomoléculas. Entre ellos, las MNP resultan especialmente atractivas por su seguridad y versatilidad. Sin embargo, hasta donde sabemos, su potencial para la entrega de proteínas CRISPR no se ha explorado aún. Utilizando esta estrategia de nanoentrega hemos sido capaces de generar knockouts mediados por Cas9 y Cas12a en diferentes modelos celulares.

    Por último, hemos explorado el uso de Cas12a para la detección de ácidos nucleicos. En concreto, se ha aprovechado la actividad trans de Cas12a para la detección de mutaciones asociadas a melanoma de úvea en muestras de biopsia líquida. El diagnóstico precoz y el seguimiento de la enfermedad son claves para mejorar la supervivencia de los pacientes de melanoma de úvea. Además, el hecho de que la mayoría de los pacientes presenten mutaciones en el codón Q209 de GNAQ y dichas mutaciones raramente se encuentren en otros tumores, hace de este cáncer un candidato ideal para la detección de ácidos nucleicos. En este trabajo hemos diseñado una aproximación basada en Cas12a para la detección específica de GNAQ mutante. El acoplamiento de dicha detección a la amplificación de ácidos nucleicos ha permitido detectar la mutación con alta especificidad y sensibilidad en muestras de plasma de pacientes de melanoma de úvea, lo que demuestra su aplicabilidad clínica para biopsia líquida.

  • English

    CRISPR/Cas technology has revolutionised genome editing. CRISPR nucleases provide a versatile toolbox that has been used for knockout and knock-in generation, base-editing and transcriptional modulation. In addition, certain Cas proteins, such as Cas12a or Cas13, possess an additional trans nuclease activity that can be exploited for nucleicacid sensing. The CRISPR/Cas system holds therefore great promise for the treatment and diagnosis of numerous diseases. This project, focused on the DNA-targeting nucleases Cas12a and Cas9, aimed to explore both aspects.Genetic disorders are the main targets for CRISPR therapeutics. This is a very heterogeneous group of diseases that cause high mortality and morbidity worldwide. Specific DNA cleavage by Cas nucleases paves the way for targeted modification of thegenetic changes underlying such disorders. This modification can occur via two differentDNA repair pathways that become active upon CRISPR cleavage: non-homologous end joining, and homology directed repair. Non-homologous end joining is an error-pronerepair mechanism that can be harnessed to disrupt the expression of pathogenic genes. Homology-directed repair enables precise gene editing, which may be exploited, for instance, to correct pathogenic mutations. However, it is severely limited by its low efficiency. In this thesis, we have explored the therapeutic potential of both repair pathways with a particular focus on CRISPR ribonucleoprotein delivery. To this end, the first step has been to implement a protocol for the heterologous expression and purification of Cas12a and Cas9 proteins, as well as a series of assays to validate their nuclease activity both ex cellullo and in cellullo...