Sistema de reparación de emparejamientos erróneos mediado por NucS en Mycobacterium smegmatis: estudios de expresión, interacción y evolución de la resistencia a rifampicina

• Autores: Esmeralda Cebrián Sastre
• Directores de la Tesis: Jesús Blázquez Gómez (dir. tes.), Alfredo Castañeda García (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2024
• Idioma: español
• Número de páginas: 258
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  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • NucS se ha establecido como la proteína central del sistema de reparación de emparejamientos erróneos (MMR) no canónico en arqueas y actinobacterias, incluyendo Mycobacterium tuberculosis, agente causante de la tuberculosis, enfermedad que sigue siendo una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Este sistema es esencial para mantener una baja tasa de mutación, evitar la acumulación de transiciones e impedir la recombinación homeóloga. En esta tesis doctoral se ha abordado el estudio del sistema de MMR de micobacterias en la especie modelo no patógena y de crecimiento rápido Mycobacterium smegmatis. Los cambios en la expresión de los sistemas de MMR pueden dar lugar a una hipermutación transitoria y al subsiguiente aumento de la aparición de mutaciones, algunas de las cuales pueden suponer una ventaja adaptativa frente a la exposición a antibióticos. Por este motivo, el estudio de los mecanismos moleculares que controlan la expresión y regulación de nucS podría ser fundamental para comprender la adquisición de resistencia a antibióticos en micobacterias. En este trabajo, se han dado los primeros pasos en la caracterización de la región promotora del gen, con la identificación de dos inicios de transcripción. Además, se ha demostrado que la regulación de nucS es dependiente de la fase de crecimiento, reduciéndose la expresión del gen en fase estacionaria, al igual que ocurre con los componentes del sistema de MMR canónico. Este descenso de la expresión de nucS en fase estacionaria podría estar mediado por sigB, pero son necesarios más estudios para confirmarlo. Por otra parte, se han seleccionado varios compuestos candidatos que podrían tener un papel en la regulación de nucS. Adicionalmente, se ha estudiado el efecto de la ausencia de nucS en el transcriptoma global de M. smegmatis tanto en fase exponencial como en fase estacionaria. Se encontró un mayor número de genes expresados diferencialmente en fase exponencial. Muchos de los genes que presentan cambios en su patrón de expresión en el mutante ΔnucS están relacionados con el metabolismo de lípidos y el transporte o adquisición de hierro, entre otras funciones, pudiendo tener esto un efecto en la fisiología bacteriana. Por otra parte, actualmente, se desconocen el resto de componentes de la ruta de MMR en micobacterias. En este trabajo, se han estudiado posibles interacciones proteicas con NucS mediante el sistema M-PFC (Mycobacterial Protein Fragment Complementation). Se ha confirmado la interacción de NucS con β-clamp, demostrándose que esta tiene lugar a través de los últimos aminoácidos del extremo C-terminal. En cuanto a RecA y MSMEG_0866 (helicasa), detectadas previamente en un ensayo de pull-down, no se ha confirmado la interacción con NucS mediante este sistema, aunque aún no podemos descartar su pertenencia a la ruta.Por último, se ha llevado a cabo un análisis de acumulación de mutaciones (MA/WGS) en presencia de rifampicina tanto en una cepa silvestre como en una cepa ΔnucS de M. smegmatis. La resistencia a rifampicina en M. tuberculosis supone un grave problema de salud pública, por lo que los estudios para comprender cómo evolucionan las micobacterias para adquirir resistencia a este antibiótico resultan esenciales. Al comparar los resultados de este ensayo con los de un experimento de MA previo realizado en ausencia de antibiótico, determinamos que el tratamiento con rifampicina duplica la tasa de mutación de la cepa silvestre de M. smegmatis. Además, se observó que la ausencia de nucS acelera la adquisición de mutaciones en rpoB, dando lugar a mayores niveles de resistencia. Así mismo, el uso de una cepa deficiente en nucS permitió identificar potenciales genes implicados en mecanismos de resistencia a rifampicina independientes de rpoB, destacando algunos que codifican proteínas de trasporte de membrana. Este trabajo es el primero en explorar las mutaciones totales del genoma mediante un experimento de MA/WGS en presencia de rifampicina en micobacterias, poniendo el foco en la tasa de mutación y en las trayectorias evolutivas hacia la resistencia a antibióticos