Resumen de Incremento de la eficiencia reproductiva de la cría porcina mediante la aplicación de nuevas técnicas avanzadas de análisis de la cromatina espermática y selección por coloide
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El sector porcino es una pieza clave en la economía española. España es líder europeo en la producción de carne de cerdo y ocupa el segundo puesto a nivel mundial en cuanto a su exportación. Por ello, la industria porcina es muy competitiva en nuestro país, siendo el objetivo producir más y mejor con menos animales criados, reduciendo la presión ambiental en un mercado en el que los costes van en aumento debido a la implementación de mejoras que permiten un seguimiento individualizado de los animales. Por ello, se usan técnicas de reproducción como la inseminación artificial (IA), para reducir el número de animales. Actualmente, el sector porcino se enfrenta a dos grandes retos: el uso de antibióticos las dosis de IA (debido a la contaminación bacteriana de las dosis refrigeradas, que afecta a la fertilidad) y la detección de verracos subfértiles.
El uso incontrolado de antibióticos ha generado una de las mayores crisis sanitarias en el mundo actual: la resistencia antimicrobiana. Por ello, se pide un uso controlado de los antibióticos, con fines terapéuticos y solo cuando sean estrictamente necesarios. Para intentar solucionar este problema, esta Tesis propone reemplazar el uso de antibióticos en las dosis de IA utilizando un método físico para eliminar bacterias, mediante coloides y centrifugación. Los coloides comenzaron a usarse con dos capas de gradientes de densidad (DGC) y, posteriormente pasó a utilizarse una centrifugación en una sola capa (SLC), para ahorrar tiempo y dinero. En la SLC en porcino se utiliza el coloide Porcicoll, pero se necesita evaluar si una densidad muy baja del coloide es eficaz para eliminar las bacterias al procesar un gran volumen de eyaculado, y su efecto sobre los espermatozoides, para determinar su utilidad práctica en la industria porcina.
Por ello, en los capítulos IV y V se procesó un gran volumen de muestra espermática usando el Porcicoll a una baja concentración (20 % y 30 %, P20 y P30) para evaluar si era eficaz eliminando o reduciendo la contaminación bacteriana. También se evaluó el efecto sobre los espermatozoides, analizando la recuperación, el efecto sobre los parámetros fisiológicos (capítulo IV) y el estado de la cromatina espermática mediante un análisis de correlaciones canónicas (CCA), que permitió estudiar las relaciones entre la microbiología y los parámetros espermáticos (capítulo V). Los resultados son muy prometedores, ya que se consiguió reducir o eliminar todas las bacterias, especialmente con P30. Tanto P20 como P30 favorecieron el mantenimiento de la calidad seminal durante el almacenamiento frente al tratamiento control. Respecto a la cromatina, se observó un incremento de los puentes disulfuro tras el almacenamiento, mejorando la compactación. El uso de CCA demostró ser eficaz para interpretar un gran número de variables simultáneamente.
En un estudio subsiguiente (capítulo VI) evaluamos la capacidad de la SLC con P20 y P30 para eliminar bacterias específicas mediante un diseño de spiking con especies bacterianas relevantes. Los resultados corroboraron la eliminación o reducción de la carga bacteriana tras aplicar la SLC, especialmente con P30, y una mejor calidad espermática tras el almacenamiento en las muestras procesadas. Los resultados de este estudio apoyaron los de los capítulos IV y V sobre la aplicabilidad de la SLC en el sector porcino, siendo una opción para procesar muestras de alto valor genético.
Por tanto, en la línea de sustitución de antibióticos en las dosis de IA, P30 parece ser una buena opción, con una recuperación espermática aceptable y una reducción muy eficiente de las bacterias, lo que resultó en dosis espermáticas con una calidad mejorada. Este efecto se produjo no sólo por la eliminación bacteriana, sino también por un efecto directo en la población espermática.
El último capítulo (VII) profundiza en la línea de estudio de la cromatina espermática en los capítulos V y VI. El éxito de la IA depende de una correcta estructura de la cromatina espermática, que es crucial para la fertilidad. Por ello, se están intentando aplicar nuevos métodos que permitan identificar alteraciones en la cromatina y detectar verracos subfértiles. El análisis de la cromatina porcina es especialmente complejo debido a su estructura, altamente compactada.
Esta Tesis ha desarrollado y evaluado técnicas para realizar un estudio integral de la cromatina, detectando daños en el ADN y cambios en su estructura. Todas las variables se evaluaron globalmente usando un análisis multivariante, para evaluar la asociación entre las variables y los efectos de varios factores. Encontramos que los parámetros que indican daños en la cromatina mostraron dinámicas distintas durante el almacenamiento refrigerado de las dosis. Así, inicialmente las especies reactivas de oxígeno (ROS) y la oxidación en el ADN espermático no se correlacionaron, pero sí lo hicieron tras el almacenamiento. Lo contrario ocurrió entre las variables de la fragmentación y la oxidación en el ADN, que mostraron una correlación inicial, que desapareció tras 11 días.
Además, en este capítulo (VII) realizamos un análisis de componentes principales (PCA), que mostró que el PC (componente principal) que capturó la mayor parte de la varianza estaba principalmente asociado con el análisis de puentes disulfuro, sugiriendo que su dinámica puede ser relevante durante el almacenamiento refrigerado. Además, parece que los parámetros derivados del sperm chromatin structure assay (SCSA) y 8–oxo–7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) aportan información diferente sobre la cromatina y complementaria, quizás, a la de los puentes disulfuro. La combinación de la evaluación de SCSA, 8-oxo-dG y de los puentes disulfuro parece proporcionar una imagen completa del estado del núcleo espermático en verraco. En concreto, la detección de la oxidación del ADN con 8-oxo-dG (puesta a punto para porcino en esta Tesis) y la evaluación de los puentes disulfuro podrían ser útiles detectando la variabilidad entre los machos (detección de la subfertilidad) tras el almacenamiento. Sin embargo, la cromomicina A3 (CMA3) fue menos informativa. Los resultados de esta Tesis deberían ensayarse con estudios de fertilidad para obtener conclusiones robustas sobre la utilidad de estas técnicas para mejorar y predecir la fertilidad de los verracos, lo cual aportaría información útil y potencialmente aplicable al sector porcino, que obtendría grandes beneficios.
- English
The porcine sector is a crucial part of the Spanish economy. Spain is the European leader in pork production and ranks second worldwide in the export of this meat. For this reason, the pig industry is very competitive in our country, the objective being to produce more and better meat with fewer animals raised, reducing environmental pressure in a market in which costs are increasing due to the implementation of improvements that allow individualized monitoring of animals. Therefore, reproduction techniques such as artificial insemination (AI) are used to reduce the number of animals. Currently, the pig sector faces two significant challenges: the use of antibiotics in insemination doses (due to the bacterial contamination of refrigerated insemination doses, which affects fertility) and the detection of subfertile boars.
The uncontrolled use of antibiotics has generated one of the biggest health crises in the world today: antimicrobial resistance. For this reason, a controlled use of antibiotics is requested, only for therapeutic purposes and when strictly necessary. To solve this problem, this Thesis proposes replacing antibiotics in AI doses with a physical method to eliminate bacteria using colloids and centrifugation. Colloids began to be used with two layers of density gradients (DGC), and later, single layer centrifugation (SLC) was used to save time and money. The SLC method has been tested with Porcicoll colloid in swine, where large volumes of ejaculate need to be processed to be useful in the practice. Therefore, it is necessary to evaluate whether a very low colloid density effectively eliminates bacteria when processing a large volume of ejaculate, and its effect on spermatozoa, to establish its practical usefulness to carry out in the swine industry.
Therefore, in chapters IV and V, a large volume of sample was processed using the Porcicoll colloid at a low concentration (20 % and 30 %, P20 and P30) to check if it effectively eliminated or reduced bacterial contamination. Sperm recovery, the effect on sperm physiological parameters (chapter IV), and the state of sperm chromatin were evaluated using canonical correlation analysis (CCA), which allowed the multivariate study of the relationships between microbiology and sperm parameters. (chapter V). The results were promising since all bacteria were reduced or eliminated, especially with P30. Compared to the control, P20 and P30 favored maintaining semen quality during storage. Regarding chromatin, an increase in disulfide bridges was observed after storage, improving compaction. The use of CCA proved to be effective in interpreting many variables simultaneously. In a subsequent study (chapter VI), we evaluated the ability of SLC with P20 and P30 to eliminate specific bacteria using a spiking design with relevant bacterial species. The results corroborated the elimination or reduction of the bacterial load after applying SLC, especially with P30, and better sperm quality after storage in the processed samples. The results of this study supported those of chapters IV and V on the applicability of SLC in the pig sector, being an option to process samples of high genetic value.
Therefore, replacing antibiotics in insemination doses using the Porcicoll colloid, P30 seems a good option. It has an acceptable sperm recovery and a very efficient reduction of bacteria, which resulted in sperm doses with improved quality. This effect occurred not only due to bacterial removal but also due to a direct impact on the sperm population. The last chapter (VII) delves into the line of study of sperm chromatin in chapters V and VI. The success of AI depends on correct sperm chromatin structure, which is crucial for fertility. For this reason, attempts are being made to apply new methods for detecting alterations in chromatin to detect subfertile boars. The detection of alterations in the chromatin of porcine sperm is especially complex due to its highly compact structure.
This Thesis has developed and evaluated techniques to conduct a comprehensive study of chromatin, detecting DNA damage and changes in its structure using methods to assess all variables globally. We used multivariate analysis strategies to evaluate the association between the variables and the effects of various factors. We found that the parameters defining the chromatin damage showed different changes throughout the refrigerated storage of sperm doses. Thus, no correlation was initially observed between reactive oxygen species (ROS) and sperm DNA oxidation, but these variables were correlated after storage. The opposite occurred between the DNA fragmentation and oxidation variables, which showed an initial correlation that disappeared after 11 days.
In addition, in this chapter (VII) we performed a principal component analysis (PCA), in which the PC (principal component) that captured most of the variance was fundamentally associated with the disulfide bridge analysis, suggesting that its dynamics may be relevant during refrigerated storage. Furthermore, parameters derived from sperm chromatin structure assay (SCSA) and 8–oxo–7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8–oxo–dG) may contribute different information about chromatin and perhaps complementary to that provided by disulfide bridges. The combination of the evaluation of SCSA, 8-oxo-dG and disulfide bridges seems to provide a complete picture of the state of the sperm nucleus in boars. Specifically, detecting DNA oxidation with 8-oxo-dG (developed for pigs in this Thesis) and evaluating disulfide bridges could be helpful by detecting variability between males (detection of subfertility) after storage. However, chromomycin A3 (CMA3) was less informative.
The results of this Thesis should be tested with fertility studies to obtain robust conclusions about the usefulness of these techniques in improving and predicting the fertility of boars, which would provide helpful and potentially applicable information to the pig sector and would obtain great benefits.
