Caracterización de un modelo celular diseñado para el tamizaje genético mediante RNA de interferencia en el complejo macrófago – infectado por Leishmania (Viannia) braziliensis
- Autores: Clemencia Ovalle Bracho
- Directores de la Tesis: Carlos Arturo Clavijo Ramírez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Nacional de Colombia (UNAL) ( Colombia ) en 2015
- Idioma: español
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: repositorio.unal.edu.co
- Resumen
Las leishmaniasis son un grupo de enfermedades causadas por diferentes especies de parásitos del género Leishmania. En el desarrollo de la enfermedad el establecimiento de la infección es obligatorio y se da en parte, por la supervivencia y replicación del parásito en el macrófago. Por lo anterior es importante estudiar los mecanismos moleculares implicados en la interacción macrófago-Leishmania. La mayoría de los trabajos realizados sobre el efecto de la infección de Leishmania en la expresión de genes del macrófago se ha desarrollado con especies del subgénero Leishmania y en momentos iniciales de la infección. El objetivo de este trabajo fue identificar en la etapa del establecimiento de la infección, los genes y los procesos biológicos del macrófago potencialmente importantes en la interacción macrófago - L. braziliensis y caracterizar un modelo celular que permita la evaluación funcional de los genes identificados. El perfil de expresión de genes diferencialmente expresados entre macrófagos no infectados e infectados, se determinó por ensayos de microarreglos y los procesos biológicos por análisis de enriquecimiento funcional. Se evaluó el modelo celular: macrófagos derivados de la línea celular U937, en términos de su capacidad para ser modificado genéticamente, permitir el silenciamiento de genes por RNA de interferencia (shRNA) y permitir la identificación de cambios fenotípicos de infección, causados por dicho silenciamiento genético. Para lo anterior se expresó y silenció el gen gfp y se silenciaron los genes lmna y gro-β. El silenciamiento de los genes fue evaluado midiendo los niveles de expresión de la proteína por western blot y el efecto del silenciamiento, evaluando el fenotipo de infección de los macrófagos en términos de carga parasitaria y porcentaje de macrófagos infectados en las líneas silenciadas y en las líneas control. El proceso de silenciamiento fue exitoso para los tres genes estudiados obteniendo reducción del 88.9% en los niveles de GFP, del 87,5% en los niveles de LMNA y del 74,4% para Gro-β. El modelo celular permitió evidenciar cambios en la susceptibilidad de la infección de los macrófagos infectados por L. braziliensis, como consecuencia del silenciamiento genético. Los ensayos de microarreglos permitieron identificar 218 genes diferencialmente expresados entre macrófagos no infectados e infectados con L. (V.) braziliensis, y con base en los ensayos de enriquecimiento funcional se determinó que la biosíntesis de esteroles, específicamente la del colesterol era el principal proceso asociado. Los genes asociados a la biosíntesis del colesterol estaban regulados negativamente. Este es el primer estudio que reporta el perfil de expresión génica de macrófagos infectados por L. (V.) braziliensis y el proceso biológico principalmente asociado durante el establecimiento de la infección.
