Estado mitocondrial y caracterización bioenergética de las células humanas de la granulosa
- Autores: Gustavo Nardini Cecchino
- Directores de la Tesis: Juan Antonio García Velasco (dir. tes.), Eduardo Leme Alves da Motta (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Rey Juan Carlos ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Ángel Checa Vizcaíno (presid.), Francisco Gómez Esquer (secret.), Ana Carolina Japur de Sá Rosa Silva (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud por la Universidad Rey Juan Carlos
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
Antecedentes: La edad es el principal factor que influye en la capacidad reproductiva de las mujeres. En los últimos años, investigaciones centradas en la relación entre el envejecimiento y la función mitocondrial ha ganado protagonismo en diferentes áreas, incluso en la medicina reproductiva. Se sabe que las mitocondrias están involucradas en procesos críticos que determinarán la calidad del ovocito y la competencia embrionaria. Además, el sinergismo metabólico entre los ovocitos y las células de la granulosa es crucial para la maduración ovocitaria durante el desarrollo folicular, lo que afectará la calidad del ovocito y también el resultado reproductivo en los tratamientos de reproducción asistida. Objetivos: Profundizar el conocimiento sobre el tema de las mitocondrias y la senescencia reproductiva, además de investigar la función mitocondrial y el metabolismo energético de las células de la granulosa en mujeres de distintas edades. Metodología: Esta tesis se dividió en 3 pasos distintos. En la primera etapa se realizó una búsqueda sistemática en PubMed englobando artículos originales y revisiones utilizando los siguientes descriptores: ¿mitochondria¿, ¿oocytes¿, ¿reproductive techniques, assisted¿, ¿fertility¿, ¿mitochondrial DNA¿, ¿embryo¿, ¿blastocyst¿, y ¿granulosa cells¿. También se utilizaron las referencias contenidas en los artículos seleccionados. En la segunda etapa llevamos a cabo un estudio piloto prospectivo observacional y de prueba de concepto comparando la concentración intracelular de trifosfato de adenosina (ATP) en células de la granulosa de 26 mujeres de diferentes edades sometidas a un ciclo de fertilización in vitro (FIV): 13 donantes de ovocitos menores de 35 años, y 13 mujeres infértiles mayores de 38 años. Inmediatamente después de la aspiración de los folículos para la recolección de ovocitos, las células de la granulosa luteinizadas fueron aisladas y purificadas a partir del líquido folicular de los folículos por encima de 14 mm siguiendo un protocolo estricto. Las muestras se congelaron a -80ºC para luego determinar los niveles de ATP intracelular a través de un kit de bioluminiscencia. En la tercera etapa realizamos un estudio cohorte observacional prospectivo incluyendo 127 mujeres en tratamiento de FIV y que se dividieron en 2 grupos según la edad: un grupo de mujeres infértiles mayores de 38 años y un grupo control de donantes de ovocitos menores de 35 años. Las células se aislaron de manera similar al estudio anterior, pero estas células se analizaron frescas sin someterlas a congelación, lo que podría ser un sesgo para el metabolismo energético celular. Primero, determinamos el perfil bioenergético de las células de la granulosa y del cumulus utilizando la tecnología del analizador de flujo extracelular Agilent Seahorse XF24, que permite la evaluación en tiempo real de distintos parámetros de la fosforilación oxidativa mitocondrial y de la capacidad glucolítica. Además, se evaluó la carga energética de las células de la granulosa a través de la determinación de los niveles de adenosina monofosfato (AMP), adenosina difosfato (ADP) y ATP mediante cromatografía líquida de alta eficacia. Resultados: En el primer artículo de revisión exploramos, entre otras cosas, el patrón de herencia mitocondrial de los embriones, el impacto de la función mitocondrial y de la producción de energía celular en la calidad del ovocito y desarrollo embrionario, diferentes factores que generan estrés oxidativo e intervienen en la fertilidad femenina y en los tratamientos reproductivos, biogénesis del ácido desoxirribonucleico (ADN) mitocondrial en ovocitos y embriones, además de posibles estrategias terapéuticas centradas en la mejora del rendimiento mitocondrial y, en consecuencia, en el resultado reproductivo. En el segundo artículo revisamos críticamente el nivel y la calidad de la evidencia científica detrás del uso de las nuevas herramientas de cuantificación del ADN mitocondrial como forma de evaluar la capacidad embrionaria. Asimismo, exploramos el uso de la cuantificación del ADN mitocondrial en ovocitos y en las células de la granulosa y del cumulus, y su posible relación con los resultados reproductivos. En el último artículo de revisión sistemática hemos recopilado la literatura más actual sobre el efecto del envejecimiento en la capacidad reproductiva, el metabolismo mitocondrial, el suministro de energía al huso meiótico, el estrés oxidativo y la homeostasis metabólica, la homeostasis del calcio en los ovocitos, la contribución de las mitocondrias a la regulación epigenética en los ovocitos, la importancia del ADN mitocondrial en el envejecimiento de los ovocitos, además de las estrategias terapéuticas para restaurar o retrasar el envejecimiento de los ovocitos. Luego, conducimos un estudio piloto prospectivo observacional comparando la concentración intracelular de ATP en células de la granulosa de mujeres de diferentes edades. Las únicas diferencias que encontramos están relacionadas con las características basales de los pacientes, en particular la edad (factor de división de los grupos), el recuento de folículos antrales y los niveles de hormona antimulleriana, lo que se explica por la diferencia de edad. Asimismo, el número total de ovocitos y ovocitos maduros recuperados fue mayor en el grupo de pacientes jóvenes. Sin embargo, los niveles de ATP en las células de la granulosa fueron similares en ambos grupos. Además, no encontramos correlación entre los niveles de ATP y el número de ovocitos recuperados en ninguno de los grupos. Finalizamos este estudio con una reflexión crítica en centrarse solo en la determinación de ATP intracelular como forma de evaluar el metabolismo energético. La bioenergética celular es muy compleja y la concentración de ATP por sí sola parece ser un parámetro que no refleja con precisión el estado energético de las células. Finalmente, realizamos un estudio cohorte observacional prospectivo con el objetivo de evaluar el impacto de la senescencia reproductiva en el metabolismo energético de las células de la granulosa y del cumulus. Así, se pudo caracterizar que dichas células que, además de presentar un perfil altamente glucolítico, necesitan la presencia de sustancias que se encuentran en el líquido folicular para realizar correctamente la respiración celular y la función mitocondrial. Igualmente, encontramos que las células de la granulosa de mujeres en edad reproductiva avanzada tienen una disminución general de la función mitocondrial y la glucólisis, lo que resulta en una menor carga energética comprobada al evaluar los niveles de AMP, ADP y ATP mediante cromatografía líquida de alta eficacia. Conclusiones: Esta tesis permitió avances en la comprensión del metabolismo energético de las células humanas de la granulosa, además de identificar cambios relacionados con la senescencia reproductiva. De esta forma, se demuestra la existencia de nuevas ventanas de oportunidad desde un punto de vista diagnóstico y terapéutico utilizando diferentes parámetros bioenergéticos.
