Resumen de Nuevo papel de ERK en la regulación transcripcional de MYC
- español
1. Introducción Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) desempeñan un papel fundamental en la transmisión de señales externas generadas por estímulos al núcleo, donde activan los programas genéticos necesarios para la proliferación, diferenciación y supervivencia celular, además de cientos procesos celulares y tejido-específicos (Robinson & Cobb, 1997). En concreto, en la ruta de señalización Ras-ERK, los factores de crecimiento activan a Ras, una GTPasa que posteriormente induce una cascada de fosforilaciones que activan al resto de componentes de la ruta: Raf, MEK y ERK. Una vez activado, ERK puede quedarse en el citoplasma y actuar sobre sus sustratos citoplasmáticos, o translocarse al núcleo, donde puede regular la expresión génica de una amplia gama de factores de transcripción (Elk-1, CREB) (Whitmarsh, 2007), entre los que se encuentra MYC (Sears et al., 2000). Sin embargo, en los últimos años se ha demostrado que ERK también puede regular procesos como la expresión génica y la arquitectura de la cromatina independientemente de su actividad quinasa (Rodríguez & Crespo, 2011). Además, se ha publicado que ERK2 se une a promotores de genes activos, uniéndose al DNA con un motivo definido: C/G-AAA-G/C (Hu et al., 2009).
En concreto MYC es uno de los genes cuya proteína está regulada por ERK. MYC es un factor de transcripción que, a su vez, regula la expresión de diversos genes (entre 1000 y 4000) y su expresión está altamente controlada por mecanismos transcripcionales, postranscripcionales y pos-traduccionales (Coller et al., 2000; Fernández et al., 2003; Guo et al., 2000). En tumores, la expresión del gen MYC a menudo se desregula a través de diversos mecanismos que incluyen: mutaciones estabilizadoras, translocación cromosómica, amplificación de genes y sobreexpresión de la transcripción (Meyer & Penn, 2008); siendo ésta última la más frecuente. MYC se expresa en células en crecimiento, mientras que en células quiescentes su transcripción se encuentra inhibida (Albert et al., 2001). En cuanto a sus funciones biológicas se encuentran la regulación del ciclo celular, metabolismo, inmortalización, apoptosis, etc.; todo ello dependiendo de si su actividad transcripcional está activada o inhibida (Grandori et al., 2000). Sin embargo, a pesar del amplio conocimiento sobre muchas de las funciones de MYC, falta un conocimiento detallado de los procesos que se desarrollan en su promotor, responsable de la regulación de la producción transcripcional de MYC, tanto en entornos fisiológicos como patológicos.
Las proteínas quinasas y fosfatasas determinan el balance de fosforilaciones a nivel celular, lo cual supone un cambio funcional en muchas proteínas, alterando, por ejemplo, su localización celular, su estabilidad o su asociación a otras proteínas. Las quinasas dependientes de ciclina (CDK) son serina-treonina quinasas que funcionan para coordinar múltiples funciones celulares. Dependiendo de su función, podemos dividir las CDKs en aquellas que están involucradas principalmente en la regulación del ciclo celular (CDK1, CDK2, CDK4 y CDK6) o aquellas que juegan un papel en la regulación de la transcripción para influir en la proliferación y supervivencia celular al impulsar la expresión de numerosos genes diana (CDK7-9, CDK11-13, CDK19) (Malumbres et al., 2009).
En concreto, la transcripción de genes es un proceso llevado a cabo por la ARN polimerasa II (Pol II) y está altamente regulado, siendo las CDKs muy importantes en dicho proceso. La transcripción génica está dividida en cuatro partes: inicio, pausa, elongación y terminación (Parua & Fisher, 2020). Poco después del inicio de la transcripción, la ARN Pol II se detiene en la región próxima al promotor del sitio de inicio de la transcripción. Para su reanudación, y regulación de la elongación, el dominio carboxi-terminal (CTD) debe ser hiperfosforilado (Gibbs et al., 2017). Existen dos principales fosforilaciones, llevadas a cabo por ciclinas dependientes de quinasas. La primera la realiza la CDK7 (que fosforila la Ser5) lo cual permite la activación de la Pol II y estimula la transcripción del RNA, pero no su elongación (Akhtar et al., 2009; Glover-Cutter et al., 2009). Posteriormente entran en juego la CDK9 y su correspondiente ciclina T (CycT), promoviendo la transición de la pausa a la elongación transcripcional mediante la fosforilación de la Ser2 (Wong et al., 2014). CDK9 y CycT juntos constituyen el factor de elongación de la transcripción positiva b (P-TEFb), cuya activación es un proceso complejo. En células de mamífero, aproximadamente la mitad de P-TEFb está presente en grandes complejos inactivos. El equilibrio de P-TEFb activo e inactivo está estrictamente controlado y puede cambiar drásticamente en respuesta a señales externas como la estimulación por factores de crecimiento (Zhou & Yik, 2006). Además, otras quinasas también participan en la activación de P-TEFb por mecanismos aún desconocidos. Por ejemplo, se ha demostrado que las señales mediadas por ERK favorecen el ensamblaje de heterodímeros CyclinT1-CDK9, lo que facilita el reclutamiento de P-TEFb a genes transcritos activamente (Fujita et al., 2008). También se ha demostrado que MYC juega un papel importante en el reclutamiento de P-TEFb en promotores de genes para ayudar en el paso de la elongación de la transcripción (Rahl et al., 2010).
Resultados previos obtenidos por nuestros colaboradores del laboratorio de Javier León, observaron que dentro del promotor MYC hay varias ERK boxes con la secuencia C/G-AAA-C/G que están altamente conservadas en humanos, ratones y ratas. Además, corroboraron mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) que ERK2 se une al promotor MYC humano y de ratón. Dada la importancia de MYC en la promoción de la pausa-liberación de la ARN polimerasa II mediante el reclutamiento de p-TEFb, también realizaron un ChIP de CDK9 y ERK2 en células HeLa y 293T, observando que ERK2 y CDK9 coinciden en la misma región del promotor de MYC. Finalmente, otro hallazgo interesante reveló que ERK2 interactúa con CDK9 observado por Proximity Ligation Assays (PLAs).
2. Objetivos En base a todos los resultados mencionados y a los datos publicados anteriormente, decidimos profundizar en el triángulo ERK2-MYC-CDK9 y nos propusimos los siguientes objetivos:
2.1. Estudiar el efecto de ERK en la regulación de MYC 2.2. Caracterizar la interacción de ERK con CDK9 y determinar las consecuencias en su funcionalidad 2.3. Estudiar si la interacción de ERK-CDK9 juega un papel en la regulación y la expresión de MYC 3. Resultados y Discusión En este proyecto hemos estudiado cómo la presencia de ERK2 en el promotor MYC, donde coincide con CDK9, regula su transcripción de manera quinasa-independiente. Para ello, empezamos analizando el efecto de ERK2 en la síntesis de MYC tras estímulos mitogénicos, donde observamos que tanto la síntesis de mRNA como de proteína se veían afectadas cuando tratábamos células NIH3T3 con diferentes inhibidores de la ruta Ras-ERK, como el inhibidor de MEK (U0126) o el inhibidor de ERK (SCH772984). Además, observamos que, en MEFs con fenotipo ERK-less, cuando eliminamos por completo ERK los niveles de MYC caían drásticamente, lo que apuntaba a ERK como un regulador directo de MYC.
Sin embargo, dado que ya estaba descrito que MYC es regulado a nivel de proteína por componentes de la ruta, quisimos discernir si el efecto que estábamos viendo era debido a una acción directa de ERK o si eran desencadenados por otros eventos transcripcionales dependientes de ERK. Para ello, utilizamos una construcción ERK2 con una señal de localización nuclear cuya secuencia permite que ERK se transloque al núcleo en ausencia de estímulos mitogénicos y permanezca constitutivamente activo. Gracias a ello, vimos que, en ausencia de suero, ERK2 era capaz de inducir la expresión de MYC a nivel de mRNA. Además, corroboramos que dicho efecto era causa directa de ERK y no de otros substratos como puede ser Elk-1. Estos resultados demostraron que la sola presencia de ERK2 nuclear es suficiente para inducir la expresión de MYC en condiciones en las que los factores de transcripción dependientes de ERK no están activos. Por lo tanto, apunta a la acción directa de ERK2 con el promotor MYC como desencadenante de la expresión de MYC.
Además de lo descrito anteriormente, vimos que el efecto de ERK2 en la expresión de MYC era independiente de su actividad quinasa, ya que observamos que mutantes deficientes en actividad quinasa eran igual de capaces de rescatar la expresión de MYC en células quiescentes cuando llevaban una señal nuclear. Asimismo, hemos determinado que la región responsable de inducir la síntesis de MYC se encuentra dentro la región "insert" de ERK2.
Por otro lado, también hemos caracterizado la unión de CDK9 y ERK2. Empezando por determinar que la unión entre ambas proteínas es específica de CDK9 y no otras CDKs como CDK7 o CDK8. Además, hemos visto que dicha interacción también ocurre con ERK1 y con mutantes de ERK2 que no tienen actividad catalítica, lo que indica que dicha interacción es independiente de la actividad quinasa de ERK2. Para poder caracterizar las regiones a través de las cuales ERK2 y CDK9 estaban interaccionando, realizamos diferentes construcciones donde fusionamos a GST diferentes partes de la proteína de CDK9 y con ellos realizamos un pull-down en células 293T donde inmunoprecipitamos ERK2. Con ello determinamos que las regiones comprendidas entre los aminoácidos 1-100 y 264-333 interaccionan con ERK2 y que dentro de dichas secuencias había un dominio de unión a ERK: un dominio D y un dominio FXF respectivamente. Para determinar qué región era crítica en dicha unión, creamos dos plásmidos con mutaciones en dichos dominios y mediante co-inmunoprecipitaciones y PLAs, determinamos que ERK2 y CDK9 se unen a través del dominio D, ya que en aquel plásmido con mutaciones en dicho dominio observamos que CDK9 y ERK2 no interaccionan, mientras que en el que tenía mutaciones para el dominio FXF sí. Además, cuando utilizamos mutantes de ERK2 en los que dichos sitios estaban eliminados o mutados, realizamos la misma observación.
También quisimos saber las consecuencias funcionales de la interacción ERK2 con CDK9. Como la fosforilación de la serina 2 del CTD de la RNA polimerasa por CDK9 es el hallmark de la activación de la elongación de la transcripción, utilizamos siRNAs para silenciar CDK9 a la vez que co-transfectamos ERK2 nuclear. Con ello observamos que es CDK9, y no ERK2, la quinasa que fosforila a la serina 2 del CTD de la RNA Pol II. Además, mediante un ensayo quinasa in vitro, confirmamos que ni ERK2, ni sus diferentes mutantes aumentan la actividad de CDK9 in vitro.
Por último, quisimos saber el efecto que la unión CDK9-ERK2 podía tener en la regulación de la expresión de MYC. Para ello, llevamos a cabo un experimento en el que se co-transfectaron células 293T con un siRNA de CDK9 y ERK2 nuclear en condiciones sin suero y vimos que el silenciamiento parcial de CDK9 es suficiente para impedir el aumento de los niveles de ARNm de MYC que es inducido por ERK2 nuclear. También vimos que al silenciar CDK9 la inducción de MYC provocada por estímulos mitogénicos se veía reducida.
En base a la bibliografía que indica que ERK2 puede unirse al promotor activo de genes y nuestras observaciones previas sobre la región "insert" de ERK2 como la región clave responsable de impulsar la expresión de MYC, pensamos que para impulsar la expresión de MYC, ERK podría estar sirviendo como link para CDK9 en el promotor MYC al unirse al ADN a través de su región insert. Para poner a prueba esta teoría, generamos una construcción quimérica en la que la secuencia correspondiente a la región "insert" de ERK2 se fusionó con el extremo C-terminal de CDK9 humano y se utilizó dicha construcción en un ensayo de luciferasa para determinar el efecto que tenía sobre el promotor de MYC. Con ello vimos que con la simple introducción de la secuencia "insert" de ERK2 en CDK9, era suficiente para reforzar la capacidad de CDK9 para inducir la expresión de MYC en condiciones de privación de suero.
4. Conclusiones 1. ERK2 regula la expresión de MYC a través de su interacción directa con el promotor de MYC, independientemente de otros eventos transcripcionales provocados por ERK.
2. Dicho mecanismo es independiente de la actividad quinasa ERK2.
3. Esta regulación requiere la interacción de ERK con CDK9. En tal complejo, ERK2 interactúa con CDK9 principalmente a través del dominio D. Al mismo tiempo, ERK2 interactúa con el promotor MYC a través de su región "insert".
4. ERK2 evoca la expresión de MYC al reclutar CDK9 en el promotor de MYC. Aunque ERK2 no induce la actividad quinasa de CDK9, sí que facilita la fosforilación mediada por CDK9 de la RNA Pol II en la serina 2 del dominio carboxi-terminal.
- English
Over the last years, it has been demonstrated that ERK2 can directly bind to active promoter of genes and regulate their expression. In this work we have unveiled a new mechanism by which ERK2 can induce MYC expression, via its direct interaction with the MYC promoter, in a kinase-independent manner. Such mechanism requires ERK2 interaction with CDK9 via binding thought its D-domain, and is independent of ERK2 kinase activity. As a result, our findings reveal an entirely new function for ERK outside of its typical kinase functions, acting as a tether for transcriptional activation at the MYC promoter.
