Identificación de proteínas inmunogenas de Brucella canis que inducen respuesta inmune humoral en humanos

• Autores: Miryan Margot Sánchez Jiménez
• Directores de la Tesis: Martha Olivera Ángel (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Antioquia ( Colombia ) en 2014
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    En el año 2005 en Medellín, el grupo de investigación Vericel de la Universidad de Antioquia aisló Brucella canis de animales enfermos en la región. En el transcurso de estos 9 años se han identificado caninos y humanos positivos para la infección por serología y hemocultivo; la presencia de factores de riesgo que se asocian a la presencia de la enfermedad por prácticas inadecuadas en los criaderos y se establecieron algunas características moleculares que permitieron identificar como Brucella canis grupo 2 las cepas que circulan en Medellín. Como una continuación del trabajo del grupo, durante esta tesis de doctorado se identificaron proteínas inmunógenas de Brucella canis (B. canis) útiles para el diagnóstico de la infección en humanos y otras posiblemente para caninos, utilizando análisis proteómicos de B. canis cepa Oliveri, aislada de un canino y cuyo genoma fue secuenciado. Se analizaron sueros de 3 grupos de personas: 1. positivas a Brucella canis por la prueba serológica tamiz, 2. positivas a Brucella abortus por rosa de bengala y 3. sueros de personas negativas para las dos pruebas serológicas. Por MALDI TOF-TOF, 35 fragmentos fueron analizados. Se identificaron 19 proteínas citoplasmáticas; 14 fueron identificadas definitivamente y sus epítopes y antigenicidad fueron caracterizados bioinformaticamente. Se consideraron proteínas inmunoreactivas de interés las presentes solo en los inmunoblots de las muestras positivas a B. canis. Para caninos se utilizó el mismo extracto proteico pero en 1DE-PAGE e inmunoblots. Se identificaron bandas inmuno reactivas de diferente peso molecular, dependiendo del estadio de la infección. Para identificar las proteínas presentes en las bandas inmuno reactivas y de membrana, extractos totales y de membrana de la cepa Oliveri se analizaron por LC-MS/MS. Según su antigenicidad y seleccionando proteínas que no hubieran sido reportadas previamente, se identificaron 3 proteínas citoplasmáticas inmuno reactivas para humanos y caninos: Inosina 5´ fosfato deshidrogenasa (GuaB-52 kDa), Piruvato deshidrogenasa E1 subunit beta (PdhB-49 kDa) y Factor de elongación Tu (Tuf-42.6 kDa). El regulador transcripcional de la familia TetR (27.4 kDa) fue inmuno reactiva solo para humanos; adicionalmente, se identificó la proteína de membrana Omp31. A continuación, de la cepa Oliveri se obtuvieron las secuencias de los genes y se realizó clonación, sub-clonación, expresión y purificación de las proteínas de interés. Posteriormente, se evaluó la presencia de anticuerpos IgG a través de ELISA indirecta utilizando las 5 proteínas recombinantes y una mezcla 1:1 de PdhB y Tuf como antígeno, en humanos y caninos. Para esto, sueros de 385 caninos de criaderos (200 de zona urbana, 185 de zona rural) y 91 humanos (52 de zona urbana, 39 de zona rural) en contacto con estos caninos, fueron evaluadas. Se determinó la sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN) y la concordancia de cada una de las ELISAs frente 2ME-PARP, hemocultivo y PCR.En humanos la iELISA de mejores desempeño fue la mezcla de las proteínas Pdhb y Tuf. Para caninos la iELISA no fue de utilidad pues los valores de Sensibilidad y Especificidad fueron bajos., La iELISA en conjunto con las otras pruebas diagnósticas, se constituyen en un panel para detectar esta infección en humanos, mejorando el diagnóstico y con la posibilidad de ofrecer en el corto plazo, la realización de estas pruebas en la región.

  • English

    Since 2005, in Medellín, Vericel research group at the University of Antioquia has studied the problem of canine brucellosis in the region. During the last 9 years, the research group has identified by serology and blood culture tests Brucella canis-positive canines and humans, the presence of risk factors associated with the development of this infection in kennels due to inadequate practices and established some molecular characteristics, which helped to identify the circulating Brucella canis in Medellin as group 2. As a continuation of the work carried by the group, during this PhD thesis, immunogenic proteins of B. canis useful for the diagnosis of infection in humans and canines were identified using proteomic analysis of B. canis str. Oliveri, isolated from a canine whose genome was sequenced in collaboration with CNSG of the University of Antioquia. Three human sera groups were analyzed: 1. B. canis-positive sera by serological screening test, 2. B. abortus-positive sera by Bengal Rose y 3. B. canis-negative and B. abortus-negative sera by both serological test.

    35 fragments were analyzed by MALDI TOF-TOF, 19 cytoplasmic proteins were identified; 14 were definitively identified and their epitopes and antigenicity were characterized using bioinformatics tools. Proteins of interest were considered as immunoreactive if they were present only in immunoblots from B. canis-positive samples.

    For canine sera, the same protein extract was used for 1DE-PAGE and immunoblotting. Immunoreactive bands of different molecular weights, depending on the stage of infection, were identified. In order to identify the proteins present in the immunoreactive bands and the membrane proteins, total protein extracts from the Oliveri strain were analyzed by LC-MS/MS. According to their antigenicity and only selecting proteins that were not previously reported as immunoreactive, 3 cytoplasmic proteins were identified for humans and canines: Inosine 5´ phosphate deshydrogenase (GuaB-52 kDa), Piruvate deshydrogenase E1 subunit beta (PdhB-49 kDa) y Elongation factor Tu (Tuf- 42.6 kDa). The transcriptional regulactor TetR (27.4 kDa) was found to be only immunoreactive in humans. The outer membrane protein 31 (Omp31) was identified as well.

    Then, the strain Oliveri gene sequences were obtained and cloning, sub- cloning, expression and purification of the proteins of interest was carried. This step was performed at two locations, Purdue University and the CNSG, in order to improve the purity of the proteins and produce the Omp31 protein.

    Next, and indirect ELISA assay was performed using the recombinant proteins with the purpose of identify IgG in humans and canines; sera from 385 kennel canines (200 urban and 185 rural dogs) and 91 humans in contact with said canines (52 urban and 39 rural humans) were tested. No human had positive blood culture and 9/91 (9.9%) had positive serology. Therefore PCR was used as a comparison test with indirect ELISAs. Sensitivity (S), specificity (Sp), positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV) and the agreement of each of the ELISAs were determined. A mixture of Pdhb and Tuf had the best performance in both humans and canines.

    Finally, it was found that in humans, the mixture of recombinant proteins can increase the diagnostic value. For canines the iELISA wasn’t useful because the sensitivity and specificity values were low. The iELISA, in conjunction with other diagnostic tests, constitute a panel for the detection of this infection in humans, improving the diagnosis and with the possibility of offering these tests in short-term in the region.