Regulación de la expresión de las oxidasas terminales de la cadena de transporte de electrones de "Pseudomonas putida" y su efecto en represión catabólica

• Autores: Ana Ugidos Valladares
• Directores de la Tesis: Fernando Rojo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
• Idioma: español
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• Resumen

  • INDICE Lista de figuras y tablas 5 Summary 7 Abreviaturas 8 Introducción 9 1.- Ruta de degradación de alcanos 11 2.- Represión catabólica 14 2.1.- Crc 15 2.2.- Cyo 17 2.3.- Otros factores: PtsN y PtsO 17 3.- La respiración en Pseudomonas 18 4.- Regulación de la expresión de los componentes de la cadena de transporte de electrones 22 4.1.- FNR: un sensor de oxígeno 23 4.2.- Proteínas de la familia RegB/RegA, un sistema de regulación redox altamente conservado 25 Objetivos 29 Materiales y métodos 31 1.-Estirpes bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos 32 2.-Medios y condiciones de cultivo 34 2 3.-Técnicas experimentales 35 3.1- Extracción de DNA, digestiones y ligaciones 35 3.2- Transformación 35 3.3- Amplificación de DNA 35 3.4- Fusiones transcripcional y traduccional a lacZ 36 3.5- Obtención de estirpes mutantes en cepas de interés 37 3.5.1.- Estirpes mutantes en citocromo oxidasas 37 3.5.2.- Estirpes mutantes en reguladores 39 3.6- Ensayos de ß-galactosidasa 40 3.7- Extracción de RNA 40 3.8- Condiciones de crecimiento para la purificación de RNA 40 3.9- PCR cuantitativa de tiempo real 41 3.10- Microarrays 42 3.11- Purificación de membranas y cuantificación de citocromo oxidasas 42 3.12- Mutagénesis dirigida, sobreexpresión y purificación de las proteínas Anr*, RoxR y RoxR* 43 3.13.- Ensayos de retraso en gel, footprinting con DNasa I e interferencia por radical hidroxilo 44 Resultados 46 1.- Efecto de la inactivación de las oxidasas terminales CIO, Aa3, Cbb3.1, Cbb3.2 y del complejo bc1 en la inducción de la ruta de degradación de alcanos 46 2.- Regulación de la expresión de las oxidasas terminales de la cadena de transporte de electrones de P. putida 49 2.1.- Efecto de ANR sobre la expresión de las oxidasas terminales Cyo, CIO, Aa3, Cbb3.1 y Cbb3.2 51 2.1.1.- Medida de los niveles de los mRNA de las oxidasas terminales por PCR de tiempo real 51 2.1.2.- Cuantificación de los niveles de citocromo oxidasas a partir de sus espectros de absorción 54 3 2.2-Unión de ANR* a DNA 55 2.2.1.- Identificación de los sitios de unión de ANR* a los promotores de las oxidasas terminales Cyo, Cbb3.1 y CIO 55 2.2.2.- Identificación de los nucleósidos importantes para la unión de ANR* a DNA 58 2.3.- Efecto del par sensor/regulador RoxS/RoxR sobre la expresión de las diferentes oxidasas terminales de P.

    putida 61 2.3.1.- Efecto de RoxR sobre las oxidasas terminales Cyo, CIO, Aa3, Cbb3.1 y Cbb3.2 61 2.3.2.- Unión de RoxR al promotor de cyoA 63 2.4.- Análisis de la expresión de los genes cyo en distintas condiciones y fondos genéticos mediante fusiones transcripcionales y traduccionales al gen lacZ 67 2.4.1- Expresión de Cyo en LB 68 2.4.2- Expresión de Cyo en medio mínimo 69 2.4.3- Efecto de la inactivación de ANR sobre la expresión de Cyo en distintas condiciones de crecimiento 70 2.4.4- Efecto de la inactivación de RoxS y RoxR sobre la expresión de Cyo en distintas condiciones de crecimiento 71 3.- Efecto de los reguladores globales ANR y RoxR en represión catabólica y en el transcriptoma de la célula 73 3.1.- Efecto de la inactivación de ANR sobre la represión catabólica 73 3.2.- Efecto de la inactivación de RoxS/RoxR sobre la represión catabólica 75 4 3.3.- Efecto de los reguladores ANR y RoxR sobre el transcriptoma celular 76 Discusión 81 1.-Cyo es la única oxidasa terminal de P. putida implicada en represión catabólica 82 2.-Los reguladores globales ANR y RoxR coordinan la expresión de las oxidasas terminales de P. putida en respuesta a oxígeno y carbono 83 2.1.-Efecto de ANR 84 2.2.-Efecto de RoxR 90 2.3.-Regulación de Cyo 94 3.-Efecto de ANR y RoxR sobre el metabolismo celular 96 3.1.-Represión catabólica 96 3.2.- Efecto sobre el transcriptoma celular 97