Ascomicetos entomopatógenos multifuncionales para el control de la "rosquilla negra" spodoptera littoralis (boisduval) (lepidoptera: noctuidae) en cucurbitáceas
- Autores: Fabián García Espinoza
- Directores de la Tesis: Enrique Quesada Moraga (dir. tes.), Meelad Yousef (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2024
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Romera Ruiz (presid.), María del Pilar Medina Vélez (secret.), José E. Belda (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ingeniería Agraria, Alimentaria, Forestal y del Desarrollo Rural Sostenible por la Universidad de Córdoba y la Universidad de Sevilla
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. Introducción o motivación de la tesis:
La búsqueda de alternativas no químicas de control de plagas se ha convertido en un pilar de las políticas agrarias a nivel mundial, y muy en especial, en el contexto europeo, como refleja la controvertida Agenda 2030. Dentro de estas alternativas, el control microbiano de plagas por medio de ascomicetos entomopatógenos (AE), en particular las especies Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Hypocreales: Cordycipitaceae) y Metarhizium brunneum Petch (Hypocreales: Clavicipitaceae), que tienen modo de acción por contacto, ha suscitado un interés creciente, no sólo por su virulencia, sino también por su carácter de microorganismos multifunción en agricultura, con asociaciones con las plantas como endófitos, epífitos o competentes en la rizosfera, de las que pueden derivarse nuevas estrategias sostenibles de protección y producción vegetal.
Los AE son microorganismos comúnmente presentes en los ecosistemas y que, con el paso del tiempo, han pasado de ser saprófitos a endófitos y a ocupar el papel de patógenos de insectos, formando parte del estilo de vida simbionte de las plantas (Barelli et al. 2016). Por esta razón, los AE pueden interactuar con los cultivos y establecer relaciones mutualistas, que terminan en múltiples beneficios para las plantas (Barelli et al. 2016, Quesada Moraga 2020, Quesada-Moraga et al. 2020). Además de su conocido papel como agentes de control biológico de plagas, aportan beneficios a las plantas tales como la promoción del crecimiento y una mejora en la adquisición de nutrientes, además de la activación de los sistemas de defensa, ayudando esto último a mejorar la tolerancia a estreses tanto bióticos como abióticos, especialmente en respuesta al ataque de herbívoros (Sánchez-Rodríguez et al. 2016, 2018, Raya-Díaz et al. 2017, González-Guzmán et al. 2020, 2022, Kuzhuppillymyal-Prabhakarankutty et al. 2020). Asimismo, es de especial interés estudiar los AE como integrantes de sistemas multitróficos, en los que son capaces de mediar en las relaciones insecto-planta y donde es evidente la potencial compatibilidad que tienen con otros agentes de control de plagas como depredadores y parasitoides, lo que los lleva a ser componentes clave en los programas de manejo integrado de plagas (MIP) (González-Mas et al. 2019, Miranda-Fuentes et al. 2020, 2021, Quesada Moraga 2020, Quesada-Moraga et al. 2022).
2.Contenido de la investigación:
En este contexto, la presente tesis doctoral ha abordado un sistema multitrófico donde tres cepas endófitas (cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum y cepas EABb 04/01-Tip y EABb 01/33-Su de B. bassiana) de las dos especies de AE mencionadas se han utilizado para el control de la plaga polífaga Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae), junto con el parasitoide koinbionte solitario Hyposoter didymator (Thunberg) (Hymenoptera: Ichneumonidae), en cultivo de melón, con atención no solo a la compatibilidad directa de los agentes de control biológico, sino al impacto de los AE sobre el crecimiento del cultivo y el efecto indirecto sobre el fitófago.
El Capítulo II, aborda el tipo de respuesta de plantas de melón inoculadas con AE al ataque de S. littoralis, así como los mecanismos moleculares que la regulan. Las plantas de melón se inocularon con tres cepas mencionadas previamente, mediante tratamiento de suelo, tratamiento de semilla y tratamiento foliar. Las plantas inoculadas mostraron antibiosis frente al nóctuido (efectos letales y subletales), así como una compensación del crecimiento o tolerancia en respuesta a diversos escenarios de infestación de este. Se registró un aumento en el peso fresco y seco de la planta, contenido de clorofila, número de ramas secundarias y diámetro del tallo, al tiempo que inducía efectos subletales en S. littoralis. Además, se observó una sobreexpresión relativa de los genes relacionados con el ET (ACO1, ACO3, EIN2, EIN3) y el ácido jasmónico (AJ) (LOX2), siendo mayor la inducción de los genes relacionados con ET y AJ, por la presencia endofítica de B. bassiana, especialmente en plantas infestadas con S. littoralis.
El Capítulo III revela los mecanismos moleculares mediante los cuales estos ascomicetos brindan protección a través de respuestas de resistencia sistémica contra insectos fitófagos. En este trabajo, se aplicó un priming en las raíces de plántulas de cucurbitáceas, pepino y melón, con la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum, y se estudió la expresión relativa de 18 genes relacionados con la síntesis de ET, AJ y ácido salicílico (AS), así como genes de proteínas relacionadas con patogénesis (PR) mediante qRT-PCR. Los efectos del priming en S. littoralis se estudiaron al exponer larvas del nóctuido a plantas que habían recibido un priming con el AE o bien plantas del testigo durante 15 días. Se observó la complejidad y el grado de solapamiento entre las rutas reguladoras, y aunque existió una sobreexpresión general de todos los genes estudiados en plantas con priming por AE, destacaron EIN2 y EIN3, genes clave en la vía de transducción de ET, que aumentaron sus niveles de expresión hasta ocho y cuatro veces, respectivamente. Se observó una mortalidad significativa de las larvas de S. littoralis alimentadas con plantas tratadas (con priming fúngico) en comparación con las plantas testigo, además de un efecto negativo del priming fúngico sobre el fitness del lepidóptero revelado por la duración de los estadíos larvarios, peso de pupas y porcentaje de pupas anormales, lo que pone de manifiesto el efecto beneficioso de la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum sobre la inducción de resistencia en cucurbitáceas. Estos resultados impulsaron la investigación llevada a cabo en el Capítulo IV, en el que se investiga el efecto de las cepas de AE sobre la adquisición del hierro (Fe), tanto in vitro en cuanto a la exudación de sideróforos, como in vivo en lo que se refiere al contenido de Fe en plantas de melón y pepino, para las tres cepas de B. bassiana y M. bruneum. La cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum mostró una gran capacidad para producir sideróforos de hierro revelada por hasta un 58.4% de cambio en la coloración del medio (de azul a naranja) por acción de la exudación de sideróforos, porcentaje que alcanzó el 24.3% y 17.8% para las cepas EABb 04/01-Tip y EABb 01/33-Su de B. bassiana, respectivamente. Asimismo, la cepa EAMa 01/58-Su proporcionó un mayor contenido de Fe tanto en materia seca como en el sustrato en comparación con el control, por lo que fue seleccionada para dilucidar la posible inducción de respuestas de deficiencia de Fe, que incluyen la Actividad de la Reductasa Férrica (ARF), y la expresión relativa de genes de adquisición de Fe mediante qRT-PCR en plantas de melón y pepino. El priming de raíces con la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum provocó respuestas a la deficiencia de Fe a nivel transcripcional, con una regulación positiva temprana (24, 48 o 72 h después de la inoculación) de los genes de adquisición de Fe como FRO1, FRO2, IRT1, HA1 y FIT, así como de la ARF.
Finalmente, en el Capítulo V, el parasitoide H. didymator fue evaluado contra S. littoralis en un sistema multitrófico en invernadero con plantas de melón colonizadas endofíticamente por las tres cepas mencionadas anteriormente. En un primer escenario, se utilizaron tres métodos de aplicación para inocular las plantas de melón con los AE, tratamiento de suelo, tratamiento de semilla y tratamiento foliar, y tras su infestación con larvas de S. littoralis, se liberó el parasitoide en una proporción de 1:20. Los métodos de detección microbiológica y molecular permitieron detectar la colonización progresiva a lo largo de todo el ciclo fenológico del cultivo, e incluso para B. bassiana, alrededor del 20% de las semillas de nuevos frutos estaban colonizadas. Se demostró que el parasitoide es compatible con todas las cepas y métodos de aplicación, con tasas de mortalidad totales que oscilaban entre el 11.1% (EAMa 01/58-Su en inoculación por recubrimiento de semilla) y el 77.8% (EAMa 01/58-Su en inoculación por pulverización foliar). Además, para diferentes combinaciones de cepa y método de aplicación, se observó una disminución del peso de pupas, mortalidad pupal (tanto normales como con deformidades), así como una extensión de los tiempos de desarrollo larvario y pupal. Asimismo, los tratamientos con AE mejoraron el crecimiento del cultivo de melón, con un incremento significativo del peso de raíces, partes aéreas (hojas y tallos) y peso total de planta. En un segundo escenario, las plantas fueron inoculadas con estas cepas, mediante pulverización localizada de dos hojas basales, y después de ser infestadas con larvas del nóctuido, se liberó el parasitoide en una proporción de 1:10, lo que permitió revelar la traslocación del AE, así como su compatibilidad con el parasitoide.
3.Conclusión:
La colonización endófita por las cepas seleccionadas de los ascomicetos entomopatógenos M. brunneum y B. bassiana, aplicadas mediante pulverización foliar, empapado de suelo y recubrimiento de semillas está demostrada en todos los experimentos, e incluso es sistémica y progresiva a lo largo de toda la fenología del melón, detectándose B. bassiana en las semillas de la generación F1.
La aplicación de las cepas seleccionadas de los ascomicetos entomopatógenas M. brunneum y B. bassiana mediante tres métodos de inoculación induce antibiosis y tolerancia frente al ataque de S. littoralis a la vez que promueve el crecimiento de la planta de melón en condiciones controladas, subrayando la multifuncionalidad de estos hongos y su novedosa función como guardaespaldas de las plantas.
Esta función de guardaespaldas se relacionó con la sobreexpresión, relacionada con la presencia endofítica de los AE, de genes relacionados con etileno (ACO1, ACO3, EIN2 , EIN3) y ácido jasmónico (LOX2), especialmente en plantas infestadas de S. littoralis.
En condiciones controladas, la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum desencadena el priming dependiente de AS y JA/ET, en plantas de pepino y melón, como inductor de resistencia sistémica (RS), tanto inducida (RSI) como adquirida (RSA), lo que resulta en una disminución significativa en el fitness de S. littoralis. Curiosamente, esta respuesta fue un priming fúngico, no necesariamente relacionado con la colonización del tejido vegetal.
La cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum es un ejemplo de la multifuncionalidad de un AE, siendo esto confirmado por el ¿crosstalk¿ entre su potencial de inducción de RS y la expresión relativa de genes de adquisición de hierro en especies de cucurbitáceas.
Las cepas seleccionadas de ascomicetos entomopatógenos M. brunneum y B. bassiana son compatibles con el parasitoide H. didymator para el control de S. littoralis en condiciones de invernadero, y el ratio de liberación de parasitoides se decidirá en función de criterios económicos.
4. Bibliografía:
Barelli L, Moonjely S, Behie SW, Bidochka MJ (2016) Fungi with multifunctional lifestyles: endophytic insect pathogenic fungi. Plant Molecular Biology 90: 657¿664. https://doi.org/10.1007/s11103-015-0413-z González-Guzmán A, Rey M-D, Froussart E, Quesada-Moraga E (2022) Elucidating the effect of endophytic entomopathogenic fungi on bread wheat growth through signaling of immune response-related hormones. Druzhinina IS (Ed.). Applied and Environmental Microbiology 88: e00882-22. https://doi.org/10.1128/aem.00882-22 González-Guzmán A, Sacristán D, Sánchez-Rodríguez AR, Barrón V, Torrent J, del Campillo MC (2020) Soil nutrients effects on the performance of durum wheat inoculated with entomopathogenic fungi. Agronomy 10: 589. https://doi.org/10.3390/agronomy10040589 González-Mas N, Cuenca-Medina M, Gutiérrez-Sánchez F, Quesada-Moraga E (2019) Bottom-up effects of endophytic Beauveria bassiana on multitrophic interactions between the cotton aphid, Aphis gossypii, and its natural enemies in melon. J Pest Sci 92: 1271¿1281. https://doi.org/10.1007/s10340-019-01098-5 Kuzhuppillymyal-Prabhakarankutty L, Tamez-Guerra P, Gomez-Flores R, Rodriguez-Padilla MC, Ek-Ramos MJ (2020) Endophytic Beauveria bassiana promotes drought tolerance and early flowering in corn. World Journal of Microbiology and Biotechnology 36: 47. https://doi.org/10.1007/s11274-020-02823-4 Miranda-Fuentes P, Quesada-Moraga E, Aldebis HK, Yousef-Naef M (2020) Compatibility between the endoparasitoid Hyposoter didymator and the entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum: a laboratory simulation for the simultaneous use to control Spodoptera littoralis. Pest Management Science 76: 1060¿1070. https://doi.org/10.1002/ps.5616 Miranda-Fuentes P, Yousef-Yousef M, Valverde-García P, Rodríguez-Gómez IM, Garrido-Jurado I, Quesada-Moraga E (2021) Entomopathogenic fungal endophyte-mediated tritrophic interactions between Spodoptera littoralis and its parasitoid Hyposoter didymator . J Pest Sci 94: 933¿945. https://doi.org/10.1007/s10340-020-01306-7 Quesada Moraga E (2020) Entomopathogenic fungi as endophytes: their broader contribution to IPM and crop production. Biocontrol Science and Technology 30: 864¿877. https://doi.org/10.1080/09583157.2020.1771279 Quesada-Moraga E, Yousef-Naef M, Garrido-Jurado I (2020) Advances in the use of entomopathogenic fungi as biopesticides in suppressing crop insect pests. In: Birch NN, Glare T (Eds), Biopesticides for sustainable agriculture. Burleigh Dodds Science Publishing, Cambridge, UK, 63¿98. https://doi.org/10.19103/AS.2020.0073.05 Quesada-Moraga E, Garrido-Jurado I, Yousef-Yousef M, González-Mas N (2022) Multitrophic interactions of entomopathogenic fungi in BioControl. BioControl 67: 457¿472. https://doi.org/10.1007/s10526-022-10163-5 Raya-Díaz S, Sánchez-Rodríguez AR, Segura-Fernández JM, Del Campillo MDC, Quesada-Moraga E (2017) Entomopathogenic fungi-based mechanisms for improved Fe nutrition in sorghum plants grown on calcareous substrates. Kuramae EE (Ed.). PLoS ONE 12: e0185903. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185903 Sánchez-Rodríguez AR, Barrón V, Del Campillo MC, Quesada-Moraga E (2016) The entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum: a tool for alleviating Fe chlorosis. Plant and Soil 406: 295¿310. https://doi.org/10.1007/s11104-016-2887-0 Sánchez-Rodríguez AR, Raya-Díaz S, Zamarreño ÁM, García-Mina JM, del Campillo MC, Quesada-Moraga E (2018) An endophytic Beauveria bassiana strain increases spike production in bread and durum wheat plants and effectively controls cotton leafworm (Spodoptera littoralis) larvae. Biol. Control 116: 90¿102. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2017.01.012
