Resumen de Construcción y caracterización de nuevos vectores retrovirales para la terapia génica del cáncer
Se han conseguido completar los siguientes tres objetivos propuestos:
1)Construcción de un vector retroviral conteniendo el gen para la linamarasa (lis). Este nuevo gen suicida cataliza la ruptura del substrato natural linamarina (lin) que permite la obtención final del HCN que destruye la célula. Este nuevo sistema "asesino-suicida" lis/lin está siendo estudiado en nuestro laboratorio para la destruccion de tumores.
2)Construcción de vectores retrovirales bicistronicos utilizando un peptido autocortante (secuencia 2A del viurs de la fiebre aftosa, FMDV). Estos vectores producen un buen titulo viral del orden de 10 6 u.f.c/ml y expresan correctamente los genes clonados delante y detrás de 2A. Igualmente se comprobó que la secuencia 2A permite la ruptura de la proteina fusion formada por ella misma y las dos proteinas que flanquean.
3)Construcción de vectores retrovirales policistronicos combinando la secuencia 2A del FMDV y varios IRES de diferentes origenes virales. Se han construido tres vectores tricistrónicos y dos tetracistronicos. Todos funcionan correctamente, obteniendose titulos virales alrededor 10 6 u.f.c./ml. Las expresiones de los genes se ha demostrado en cultivos celulares. Para comprobar la coexpresion de todos los genes, se obtuvieron clones celulares de dos vectores tricistronicos y dos tetracistrónicos. En estas líneas celulares clonales se estudiaron las expresiones de todos los genes y la integridad del provirus (mediante PCRs genómicas largas). Estos resultados indican la posibilidad de utilizar rutinariamente vectores retrovirales tricistrónicos y tetracistrónicos.
Finalmente, construimos un vector pentacistronico con la secuencia 2A y tres IRES distintos. Con esta construcción no se detectó titulo viral y solamente se expresaron los primeros tres genes. Actualmente estamos diseñados nuevos vectores pentacistronicos para comprobar si los problemas antes descritos se limitan a la construccion p
