Resumen de Estudios sobre la regulación de las rutas de degradación anaeróbica del 3-hidroxibenzoato y benzoato en Aromatoleum sp. CIB
Aromatoleum sp. CIB es un microorganismo modelo para el estudio de rutas de degradación de compuestos aromáticos, tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. En esta tesis doctoral se ha utilizado la cepa CIB para estudiar por primera vez la regulación transcripcional de la ruta central de degradación anaeróbica del 3-hidroxibenzoato (ruta hbd), y se ha expandido dicha ruta mediante ingeniería metabólica hacia el metabolismo anaeróbico de compuestos derivados de la despolimerización de lignina, e.g., protocatecuato. Por otro lado, se ha profundizado en el estudio del mecanismo de represión catabólica por carbono que regula la ruta de degradación anaeróbica del benzoato (ruta bzd) en Aromatoleum sp. CIB. El primer objetivo ha consistido en la identificación y el estudio de la organización transcripcional del cluster hbd en Aromatoleum sp. CIB. El cluster hbd se estructura en tres operones catabólicos y un operón regulador (gen hbdR) que se transcriben en la misma orientación. El cluster hbd está conservado en diferentes β-proteobacterias de los géneros Aromatoleum, Thauera, Desulfobacillus y Dechloromonas, y muy probablemente ha sido adquirido mediante transferencia génica horizontal. En el segundo objetivo se ha estudiado y caracterizado la regulación transcripcional específica del cluster hbd. El gen hbdR codifica un regulador transcripcional de la familia TetR que reprime la expresión de los tres operones catabólicos del cluster hbd. El represor HbdR ha sido purificado y es un dímero que reconoce la caja operadora consenso ATGAATGA-N1-N2-N3-N4-TCATTCAT, la cual se encuentra conservada en los promotores catabólicos del cluster hbd de la cepa CIB y de otras β-proteobacterias, sugiriendo un mecanismo de regulación conservado en todas ellas. El tercer objetivo ha consistido en el estudio de la regulación cruzada y la regulación sobreimpuesta de los genes hbd. El primer promotor del cluster hbd, PhbdN, está controlado por los reguladores HbdR, BzdR (regulador de la ruta anaeróbica del benzoato, bzd) y BoxR (regulador de la ruta aeróbica del benzoato, box), siendo el 3-hidroxibenzoil-CoA y el benzoil-CoA sus moléculas efectoras. La ausencia de varios genes esenciales en el cluster hbd, i.e., los que codifican la ferredoxina y oxidorreductasa asociada, hace necesaria la inducción de los genes bzd, i.e., bzdM y bzdV, respectivamente, lo que podría explicar la regulación cruzada entre ambas rutas. Por otro lado, los genes catabólicos hbd están sometidos a una regulación sobreimpuesta por la presencia de fuentes de carbono no aromáticas y por la ausencia de oxígeno, esta última llevada a cabo por la proteína AcpR. En el cuarto y último objetivo se ha llevado a cabo la identificación y caracterización de la proteína AccT implicada en el control de la represión catabólica por carbono del operón bzd de Aromatoleum sp. CIB en presencia de ciertos ácidos orgánicos, e.g., succinato. AccT es una PBP (Periplasmic binding protein) que interacciona con ciertos ácidos orgánicos que contienen un grupo ceto/hidroxilo en el carbono alfa (e.g., piruvato, lactato, glioxilato u oxalacetato), así como con los aminoácidos alanina y serina. AccT podría constituir un tercer componente del sistema regulador Acc que controla al promotor PN del operón bzd y que hasta la fecha se creía formado solo por la proteína sensora AccS y el regulador de respuesta AccR. Se ha podido identificar un nuevo nivel de control de la proteína AccS, que probablemente esté mediado por la interacción de su dominio periplásmico con AccT, y que se superpone al control citoplásmico de la actividad quinasa previamente descrito, cuando las células se cultivan en presencia de fuentes de carbono fermentables tales como el piruvato
